納米抗體制備

納米抗體服務(wù)簡(jiǎn)介

• 納米抗體諸多方面均優(yōu)于傳統(tǒng)抗體?；隈効苿?dòng)物重鏈抗體的VHH單域抗體的特殊結(jié)構(gòu)，兼具了傳統(tǒng)抗體與小分子藥物的優(yōu)勢(shì)，幾乎完美克服了傳統(tǒng)抗體的開發(fā)周期長(zhǎng)，穩(wěn)定性較低，保存條件苛刻等缺陷，逐漸成為新一代治療性生物醫(yī)藥與臨床診斷試劑中的新興力量。
  相比于常規(guī)抗體，納米抗體的優(yōu)勢(shì)有：
  分子量小，可穿透血腦屏障；原核或真核系統(tǒng)中高表達(dá)；特異性強(qiáng)，親和力高；對(duì)人的免疫原性弱等。

M13 噬菌體展示技術(shù)

• 噬菌體展示技術(shù)（phage display）是將外源編碼多肽或蛋白質(zhì)的基因通過基因工程技術(shù)插入到噬菌體外殼蛋白結(jié)構(gòu)基因的適當(dāng)位置，在閱讀框能正確表達(dá)，使外源多肽或蛋白在噬菌體的衣殼蛋白上形成融合蛋白，隨子代噬菌體的重新組裝呈現(xiàn)在噬菌體表面，可以保持相對(duì)的空間結(jié)構(gòu)和生物活性。
  然后利用靶分子，采用合適的淘洗方法，洗去未特異性結(jié)合的噬菌體。再用酸堿或者競(jìng)爭(zhēng)的分子洗脫下結(jié)合的噬菌體，中和后的噬菌體感染大腸桿菌擴(kuò)增，經(jīng)過多輪的富集，逐步提高可以特異性識(shí)別靶分子的噬菌體比例，最終獲得識(shí)別靶分子的多肽或者蛋白。

噬菌體文庫(kù)的構(gòu)建與納米抗體的淘選

• 美迪西生物可以提供未經(jīng)免疫的，足齡（24-36月齡）的駱駝進(jìn)行抗原免疫，按照標(biāo)準(zhǔn)免疫方法，每個(gè)項(xiàng)目免疫4-6針，免疫期間為客戶提供ELISA效價(jià)測(cè)定服務(wù)，保證抗血清ELISA效價(jià)合格后采血分離PBMC。
  美迪西生物采用M13噬菌體的pIII蛋白進(jìn)行VHH抗體(納米抗體)表面展示。我們的科學(xué)家構(gòu)建了帶有HA和6*His tag雙標(biāo)簽的噬菌粒載體，同時(shí)制備出了具有10⁸轉(zhuǎn)染效率的TG1宿主菌感受態(tài)，經(jīng)過2-3次轉(zhuǎn)染與擴(kuò)增，能夠?yàn)榭蛻籼峁┯行?kù)容量大于10⁸的高質(zhì)量VHH抗體展示文庫(kù)。經(jīng)過幾輪納米抗體文庫(kù)淘篩，即可獲得至少20株具有高親和力的噬菌體株。

駱駝與羊駝VHH抗體文庫(kù)對(duì)比

• 比較項(xiàng)目	駱駝VHH抗體文庫(kù)	羊駝VHH抗體文庫(kù)
  抗原耐受量	高，可多種抗原混合高劑量免疫	較高，多種抗原混合中等免疫劑量
  HCAb血清中球蛋白比列	60%~80%	20%~30%
  中和抗體效價(jià)	高	較高
  采血量	一次可采血200ml	一次80-100ml血液
  有效庫(kù)容	高，免疫庫(kù)108-109	高，免疫庫(kù)107-108
  動(dòng)物成本	較低	高
  抗原需求量	4-6mg，純度>85%	4-5mg，純度>85%

納米抗體制備服務(wù)流程示意圖

• 

  Image source: MA Lin-lin, et al. Construction and screening of phage display library for TIM-3 nanobody. Acta Pharmaceutica Sinica2018, 53 (3): 388-395.

駝科納米抗體文庫(kù)制備項(xiàng)目流程

• 步驟	內(nèi)容	周期	交付
  第一步：抗原準(zhǔn)備	客戶提供抗原或者美迪西準(zhǔn)備抗原	3-4周	如果客戶提供抗原，質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)：1. >5mg；2. SDS-PAGE >95%
  第二步：動(dòng)物免疫	免疫未免疫的空白駱駝 5 ml 未免疫血清 ELISA檢驗(yàn)血清效價(jià)	10-12周	如果由于抗原毒性導(dǎo)致的動(dòng)物死亡,需要收取一定費(fèi)用 根據(jù) ELISA結(jié)果，客戶決定如何建庫(kù)
  第三步：抗體cDNA制備	外周血分離PBMC 提取總RNA并反轉(zhuǎn)錄為cDNA	3-4周	提供存放在Trizol 中的PBMC 提供高保真RT-PCR制備的cDNA
  第四步：噬菌體文庫(kù)構(gòu)建	構(gòu)建噬菌粒 噬菌體文庫(kù)構(gòu)建		VHH片段插入率≥75% 有效庫(kù)容量≥108CFU/mL
  第五步：噬菌體文庫(kù)淘選	噬菌體展示納米抗體，淘選，至少淘選兩輪 陽(yáng)性克隆的ELISA驗(yàn)證、鑒定、篩選和測(cè)序（200個(gè)克隆測(cè)序） 陽(yáng)性克隆測(cè)序及測(cè)序結(jié)果分析	4-6周	保證至少 20 個(gè)序列

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