上海美迪西的生物部在體外生物學(xué)領(lǐng)域擁有豐富的經(jīng)驗(yàn)，通過(guò)酶水平測(cè)定、細(xì)胞水平測(cè)定、細(xì)胞生物學(xué)、生物化學(xué)、體外同位素測(cè)定、穩(wěn)定細(xì)胞株建立、基因敲除、RNAi和MicroRNA技術(shù)等，提供一套完整的生物學(xué)服務(wù)。了解服務(wù)詳情

細(xì)胞水平分析

        技術(shù)平臺(tái)

        細(xì)胞毒性檢測(cè)

        細(xì)胞凋亡檢測(cè)分析

        細(xì)胞遷移分析

        細(xì)胞侵襲分析

        HTRF細(xì)胞水平檢測(cè)分析

        免疫染色分析

        免疫熒光分析（96/384孔板）

        報(bào)告基因分析（綠色熒光蛋白/熒光素梅）

        放射性配體受體結(jié)合試驗(yàn)

        細(xì)胞攝取分析

        基因敲除分析

        RNA干擾法

        MicroRNA過(guò)表達(dá)分析

        MicroRNA敲除分析

        有關(guān)腺病毒/逆轉(zhuǎn)錄病毒/慢病毒 載體的應(yīng)用分析

細(xì)胞凋亡或稱程序性細(xì)胞死亡（PCD）是受基因控制的一種主動(dòng)性細(xì)胞自殺過(guò)程，在形態(tài)學(xué)和生化有其明顯的特征，是有別于細(xì)胞壞死的細(xì)胞死亡方式。研究細(xì)胞凋亡的方法有很多，如形態(tài)學(xué)觀察，瓊脂糖凝膠電泳，原位末端標(biāo)記法，流式細(xì)胞儀檢測(cè)等。

細(xì)胞凋亡時(shí)，形態(tài)上，早期細(xì)胞核固縮，染色體邊集在核膜內(nèi)側(cè)顯新月體形，核碎裂；細(xì)胞體積變小，細(xì)胞漿和細(xì)胞器密度增高；線粒體正?；蜉p微腫脹；細(xì)胞膜皺折、卷曲，但早期細(xì)胞膜仍保持完整；細(xì)胞膜出泡，芽生形成膜包裹的凋亡小體，內(nèi)含完整的細(xì)胞器和核碎片。在組織中，凋亡小體常迅速被鄰近細(xì)胞吞噬，由于細(xì)胞內(nèi)容物不外溢，故周?chē)M織中無(wú)炎癥反應(yīng)。而細(xì)胞壞死時(shí)，細(xì)胞體積變大，線粒體明顯腫脹，在早期細(xì)胞膜的完整性即被破壞，胞漿內(nèi)容物外泄，引起局部炎癥反應(yīng)或組織損傷。核的變化發(fā)生較晚，主要是核溶解和消失。無(wú)凋亡小體形成。

    形態(tài)學(xué)是鑒定細(xì)胞凋亡最可靠的方法，主要有普通光學(xué)顯微鏡觀察方法，透射電子顯微鏡觀察方法和熒光顯微鏡觀察方法等，以下介紹普通光學(xué)顯微鏡觀察方法中的HE染色法以及熒光顯微鏡觀察方法中的吖啶橙染色法和吖啶橙/EB染色法。

細(xì)胞凋亡檢測(cè)方法

方法一 蘇木素——伊紅染色（HE染色法）
【原理】蘇木素容易被氧化，其氧化產(chǎn)物蘇木紅與鋁結(jié)合形成一種帶正電荷的藍(lán)色色精，與帶負(fù)電荷的脫氧核糖核酸酸根吸附而使細(xì)胞核染色。染色后必須進(jìn)行分化（differenciation）和藍(lán)化（blueing）處理。所謂分化，就是用某些試劑，將過(guò)度染色的或不需著色的組織成分上的顏色除去。所謂藍(lán)化是指用明礬蘇木素液深染細(xì)胞核后，通過(guò)鹽酸乙醇分化，切片從酸性環(huán)境中（此時(shí)，切片呈紅褐色）轉(zhuǎn)移至流水中使之變藍(lán)的過(guò)程。
伊紅Y（四嗅熒光素二鈉鹽）是一種酸性染料，可使細(xì)胞的胞漿染成粉紅色。

方法二 吖啶橙染色法
【原理】吖啶橙是最經(jīng)典的靈敏的熒光染料，它可通過(guò)與DNA和RNA的連接堿基對(duì)和磷酸鹽基團(tuán)結(jié)合，使細(xì)胞中的DNA和RNA同時(shí)染色而顯示不同顏色的熒光。吖啶橙在稀溶液中呈綠色；在濃溶液中，由于出現(xiàn)二聚體和多聚體而呈現(xiàn)橙紅色。由于DNA是高度聚合物，吸收熒光物質(zhì)的位置較少，故發(fā)綠色熒光；而RNA聚合度低，能和熒光物質(zhì)結(jié)合的位置多，故發(fā)紅色熒光。

方法三 吖啶橙/EB雙染色法
【原理】用吖啶橙染色可以檢測(cè)細(xì)胞凋亡，但不能區(qū)別活細(xì)胞和死細(xì)胞。溴化乙錠（EB）僅著染死細(xì)胞，可使DNA染成桔紅色，而僅很弱地結(jié)合RNA使之呈紅色。因此將吖啶橙和溴化乙錠混合使用，可根據(jù)兩種染料的吸收情況鑒定死細(xì)胞和活細(xì)胞。

方法四 瓊脂糖凝膠電泳法
【原理】在細(xì)胞凋亡過(guò)程中，內(nèi)源性核酸內(nèi)切酶被激活，該酶優(yōu)先作用于連接DNA的核小體間區(qū)域，將DNA鏈切割成為180～200bp或其整倍數(shù)的片段。將這些DNA片段抽提出來(lái)進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，即可出現(xiàn)梯狀電泳圖譜。壞死細(xì)胞的DNA隨機(jī)降解，并伴組蛋白的降解，故在凝膠電泳時(shí)呈模糊、彌散膜狀條帶。

方法五 原位末端標(biāo)記技術(shù)
細(xì)胞凋亡中，染色體DNA的斷裂是一漸進(jìn)的分階段的過(guò)程，其首先在內(nèi)源性核酸水解酶的作用下降解為50~300kbp的DNA大片段。然后大約30%的染色質(zhì)DNA在Ca2+和Mg2+依賴的核酸內(nèi)切酶作用下，從核小體間將DNA鏈切割成為180～200bp或其整倍數(shù)的寡核苷酸片段。染色體DNA雙鏈斷裂或單鏈斷裂而產(chǎn)生大量的粘性3'-OH末端，可在脫氧核糖核苷酸末端轉(zhuǎn)移酶（TdT）的作用下，將脫氧核糖核苷酸和熒光素、過(guò)氧化物酶、堿性磷酸酶或生物素形成的衍生物標(biāo)記到DNA的3'-末端，并通過(guò)一定的顯示系統(tǒng)使之顯示出來(lái)，從而可對(duì)完整的單個(gè)凋亡細(xì)胞或凋亡小體進(jìn)行原位染色，這類(lèi)方法稱為脫氧核糖核苷酸末端轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的缺口末端標(biāo)記法（terminal -deoxynucleotidyl transferase mediated nick end labeling, TUNEL）。由于正常的或正在增殖的細(xì)胞幾乎沒(méi)有DNA的斷裂，因而沒(méi)有3'-OH形成，所以很少能夠被染色。TUNEL實(shí)際上是分子生物學(xué)與形態(tài)學(xué)相結(jié)合的研究方法，能準(zhǔn)確地反應(yīng)細(xì)胞凋亡典型的生物化學(xué)和形態(tài)特征，并可檢測(cè)出極少量的凋亡細(xì)胞，靈敏度遠(yuǎn)比一般的組織化學(xué)法和DNA ladder測(cè)定法要高，且能早期顯示尚未發(fā)生典型形態(tài)變化的凋亡細(xì)胞，是檢測(cè)單個(gè)細(xì)胞早期出現(xiàn)凋亡現(xiàn)象的較好方法，可用于石蠟包埋組織切片、冰凍組織切片、培養(yǎng)的細(xì)胞和從組織中分離的細(xì)胞的細(xì)胞形態(tài)測(cè)定，因而在細(xì)胞凋亡的研究中被廣泛采用。
【原理】在TdT酶的作用下，生物素（biotin）標(biāo)記的dUTP可以參入到凋亡細(xì)胞DNA斷鏈的3'-OH末端，并可與連接了過(guò)氧化物酶（POD）的親和素（streptavidin）特異結(jié)合，POD可催化底物DAB產(chǎn)生很強(qiáng)的顏色反應(yīng)，特異準(zhǔn)確地定位凋亡細(xì)胞，因而在普通光學(xué)顯微鏡下，即可觀察和計(jì)數(shù)凋亡的細(xì)胞。

方法六 亞G1峰檢測(cè)法
【原理】處于增殖周期中的細(xì)胞，根據(jù)其所處不同周期時(shí)相（Go/G1、S、G2/M），其DNA含量分布在2n～4n之間。凋亡細(xì)胞的重要特點(diǎn)就是細(xì)胞凋亡過(guò)程中核酸內(nèi)切酶在DNA分子核小體間的降解。在乙醇固定和去垢劑處理后，凋亡細(xì)胞的細(xì)胞膜通透性增加，導(dǎo)致小分子DNA漏出，核DNA含量下降，以DNA特異性熒光染料染色后，形成一個(gè)DNA含量小于2n（即小于G0/G1期細(xì)胞）的分布區(qū)。 用流式細(xì)胞儀分析，可以發(fā)現(xiàn)在DNA直方圖上正常二倍體細(xì)胞的Go/G1峰前出現(xiàn)一個(gè)亞二倍體峰（Sub-G1峰，即AP峰--apoptotic peak, 也叫凋亡峰）。代表凋亡細(xì)胞。根據(jù)此亞二倍體峰可以計(jì)算凋亡細(xì)胞的百分率。

方法七  Annexin V-FITC凋亡檢測(cè)

    【原理】正?；罴?xì)胞帶負(fù)電的磷脂酰絲氨酸（Phosphatidylserine,PS）位于細(xì)胞膜的內(nèi)側(cè)，但在細(xì)胞凋亡的早期，PS可從細(xì)胞膜的內(nèi)側(cè)翻轉(zhuǎn)到細(xì)胞膜的表面，暴露在細(xì)胞外環(huán)境中。AnnexinⅤ是一種分子量為35-36kD的Ca2+依賴性磷脂結(jié)合蛋白，能與磷脂酰絲氨酸高親和力特異性結(jié)合。以標(biāo)記了FITC的AnnexinⅤ作為熒光探針，利用流式細(xì)胞儀或熒光顯微鏡可檢測(cè)細(xì)胞凋亡的發(fā)生。碘化丙啶(propidineiodide,PI)是一種核酸染料，它不能透過(guò)完整的細(xì)胞膜，但在凋亡中晚期的細(xì)胞和發(fā)生繼發(fā)壞死的細(xì)胞，PI能夠透過(guò)細(xì)胞膜而使細(xì)胞核紅染。將Annexin Ⅴ與PI匹配使用，可以將凋亡早期的細(xì)胞和晚期的細(xì)胞以及繼發(fā)壞死的細(xì)胞區(qū)分開(kāi)來(lái)。

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