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哺乳動(dòng)物蛋白表達(dá)系,具備蛋白折疊和翻譯后修飾的功能,使其蛋白更接近天然蛋白,從而獲得與天然蛋白相同的生物活性。因此使得哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)在重組蛋白藥物,特別是治療性重組單抗藥物的研發(fā)和生產(chǎn)中有最為廣泛的應(yīng)用。
? 亞克隆
? 哺乳動(dòng)物細(xì)胞瞬時(shí)表達(dá)
? 轉(zhuǎn)染優(yōu)化和表達(dá)檢測(cè)(從1L培養(yǎng)基)
? 蛋白表達(dá)
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按照宿主細(xì)胞的類型,可將基因表達(dá)系統(tǒng)大致分為原核、酵母、植物、昆蟲和哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)。與其它系統(tǒng)相比,哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)的優(yōu)勢(shì)在于能夠指導(dǎo)蛋白質(zhì)的正確折疊,提供復(fù)雜的N型糖基化和準(zhǔn)確的O型糖基化等多種翻譯后加工功能,因而表達(dá)產(chǎn)物在分子結(jié)構(gòu)、理化特性和生物學(xué)功能方面最接近于天然的高等生物蛋白質(zhì)分子。
哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng):克隆基因要在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中進(jìn)行表達(dá),必須先將基因重組到適當(dāng)?shù)恼婧吮磉_(dá)載體中。重組的表達(dá)載體在大腸桿菌中進(jìn)行擴(kuò)增,并從大腸桿菌中提取和純化重組表達(dá)載體,然后將其導(dǎo)入哺乳動(dòng)物細(xì)胞進(jìn)行表達(dá)。在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中表達(dá)的基因,可以是基因組DNA,也可以是cDNA。
編碼真核蛋白的外源基因在真核細(xì)胞中表達(dá)時(shí),表達(dá)產(chǎn)物對(duì)細(xì)胞本身的影響不大,蛋白質(zhì)本身也很少被降解。因此真核表達(dá)載體的啟動(dòng)子大多是可以持續(xù)表達(dá)的,無(wú)需誘導(dǎo)。在篩選出轉(zhuǎn)染細(xì)胞后,持續(xù)培養(yǎng),便可在上清中得到表達(dá)產(chǎn)物。
哺乳動(dòng)物表達(dá)系統(tǒng)應(yīng)用領(lǐng)域:多種基因工程藥物的生產(chǎn)平臺(tái);在新基因的發(fā)現(xiàn)、蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和功能研究中亦起了極為重要的作用。
1、昆蟲表達(dá)系統(tǒng)
昆蟲是高等真核生物,能進(jìn)行翻譯后加工和修飾。昆蟲細(xì)胞常用于真核蛋白質(zhì)的生產(chǎn)。其生長(zhǎng)速度快,不需要CO2培養(yǎng)箱,易于懸浮培養(yǎng),可用于大規(guī)模表達(dá)蛋白質(zhì)。
桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)利用一種不依賴于輔助病毒的病毒,該病毒可在適于懸浮培養(yǎng)的昆蟲細(xì)胞中增殖至高滴度,能獲得大量的重組蛋白,大部分超量表達(dá)的蛋白質(zhì)為可溶性蛋白。桿狀病毒對(duì)脊椎動(dòng)物無(wú)感染性。
2、酵母表達(dá)系統(tǒng)
酵母菌是一種單細(xì)胞真核生物,能進(jìn)行翻譯后加工和修飾。酵母菌在特定的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)迅速,與哺乳動(dòng)物細(xì)胞相比,易于操作和價(jià)格便宜。酵母表達(dá)系統(tǒng)是大規(guī)模表達(dá)重組真核蛋白的理想工具。
①部分蛋白在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的表達(dá)已從實(shí)驗(yàn)室研究邁向生產(chǎn)或中試生產(chǎn)階段。 ②已有許多重要的蛋白及糖蛋白利用哺乳動(dòng)物細(xì)胞系統(tǒng)表達(dá)和大量制備、生產(chǎn)。如人組織型血纖蛋白酶原激活因子、凝血因子Ⅷ、干擾素、乙肝表面抗原、紅血球生成激素、人生長(zhǎng)激素、人抗凝血素Ⅲ,集落刺激因子等。有些產(chǎn)品已投入臨床應(yīng)用或試用。 ③雖然經(jīng)過(guò)多年努力,哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)的表達(dá)水平有大幅度增高,但從整個(gè)水平上看仍偏低,一般處在雜交瘤細(xì)胞單克隆抗體蛋白產(chǎn)率的下限,即1-30μg/l08細(xì)胞/24小時(shí)。有人認(rèn)為其限速步驟可囂是在工程細(xì)胞中(對(duì)于重組蛋白來(lái)講,常是異源的),重組蛋白的分泌效率較低。