美迪西生物醫(yī)藥專業(yè)從事酵母雙雜交，出具權(quán)威檢測數(shù)據(jù)報告，具有獨(dú)立優(yōu)質(zhì)實(shí)驗(yàn)室，專業(yè)實(shí)驗(yàn)人員，提供詳細(xì)的酵母雙雜交實(shí)驗(yàn)步驟，原始數(shù)據(jù)和圖片，結(jié)果分析。

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    在生命活動中，DNA的復(fù)制、轉(zhuǎn)錄、RNA的剪接、蛋白質(zhì)的翻譯和分泌以及細(xì)胞周期的調(diào)節(jié)、信號傳導(dǎo)和諸多代謝過程都是各種相關(guān)蛋白質(zhì)有機(jī)相互作用的結(jié)果。細(xì)胞或組織中的蛋白質(zhì)不是雜亂無章的混合物，蛋白質(zhì)間的相互作用、相互協(xié)調(diào)是細(xì)胞進(jìn)行一切代謝活動的基礎(chǔ)。隨著分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)的飛速發(fā)展，近10年來，發(fā)展了一些研究蛋白--蛋白相互作用的方法，其中以Fields和Song創(chuàng)立的酵母雙雜交技術(shù)為最佳。該方法利用酵母生長速度快，且容易操作的特點(diǎn)，在其體系中研究哺乳動物細(xì)胞的蛋白--蛋白間的相互作用，通過篩選cDNA文庫，找到與感興趣蛋白相互作用的蛋白。

酵母雙雜交原理

酵母雙雜交系統(tǒng)的建立得力于對真核細(xì)胞調(diào)控轉(zhuǎn)錄起始過程的認(rèn)識。研究發(fā)現(xiàn)，許多真核生物的轉(zhuǎn)錄激活因子都是由兩個可以分開的、功能上相互獨(dú)立的結(jié)構(gòu)域(domain)組成的。例如，酵母的轉(zhuǎn)錄激活因子GAL4，在N端有一個由147個氨基酸組成的DNA結(jié)合域(DNA binding domain,BD)，C端有一個由113個氨基酸組成的轉(zhuǎn)錄激活域(transcription activation domain,AD)。GAL4分子的DNA結(jié)合域可以和上游激活序列(upstream activating sequence，UAS)結(jié)合，而轉(zhuǎn)錄激活域則能激活UAS下游的基因進(jìn)行轉(zhuǎn)錄。但是，單獨(dú)的DNA結(jié)合域不能激活基因轉(zhuǎn)錄，單獨(dú)的轉(zhuǎn)錄激活域也不能激活UAS的下游基因，它們之間只有通過某種方式結(jié)合在一起才具有完整的轉(zhuǎn)錄激活因子的功能。

酵母雙雜交試驗(yàn)流程

酵母雙雜交系統(tǒng)正是利用了GAL4的功能特點(diǎn)，通過兩個雜交蛋白在酵母細(xì)胞中的相互結(jié)合及對報告基因的轉(zhuǎn)錄激活來捕獲新的蛋白質(zhì)，其大致步驟為:
①視已知蛋白的cDNA序列為誘餌(bait)，將其與DNA結(jié)合域融合，構(gòu)建成誘餌質(zhì)粒。
②將待篩選蛋白的cDNA序列與轉(zhuǎn)錄激活域融合，構(gòu)建成文庫質(zhì)粒。
③將這兩個質(zhì)粒共轉(zhuǎn)化于酵母細(xì)胞中。
④酵母細(xì)胞中，已分離的DNA結(jié)合域和轉(zhuǎn)錄激活域不會相互作用，但誘餌蛋白若能與待篩選的未知蛋白特異性地相互作用，則可激活報告基因的轉(zhuǎn)錄；反之，則不能。利用4種報告基因的表達(dá)，便可捕捉到新的蛋白質(zhì)。

酵母雙雜交特點(diǎn)

優(yōu)點(diǎn):蛋白--蛋白相互作用是細(xì)胞進(jìn)行一切代謝活動的基礎(chǔ)。酵母雙雜交系統(tǒng)的建立為研究這一問題提供了有利的手段和方法。
缺點(diǎn):盡管該系統(tǒng)己被證實(shí)為一種非常有效的方法，但它也有自身的缺點(diǎn)和問題。1、它并非對所有蛋白質(zhì)都適用，這是由其原理所決定的。雙雜交系統(tǒng)要求兩種雜交體蛋白都是融合蛋白，都必須能進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)。因?yàn)槿诤系鞍紫嗷プ饔眉せ顖蟾婊蜣D(zhuǎn)錄是在細(xì)胞核內(nèi)發(fā)生的。2、假陽性的發(fā)生較為頻繁。所謂假陽性，即指未能與誘餌蛋白發(fā)生作用而被誤認(rèn)為是陽性反應(yīng)的蛋白。而且部分假陽性原因不清，可能與酵母中其他蛋白質(zhì)的作用有關(guān)。3、在酵母菌株中大量表達(dá)外源蛋白將產(chǎn)生毒性作用，從而影響菌株生長和報告基因的表達(dá)。

使用酵母雙雜交技術(shù)應(yīng)注意的問題
真正明了酵母雙雜交技術(shù)的主要原理及篩選方法是進(jìn)行酵母雙雜交實(shí)驗(yàn)的前提，構(gòu)建成功的誘餌質(zhì)粒及大量的材料準(zhǔn)備是進(jìn)行酵母雙雜交實(shí)驗(yàn)的保證。只有明了雙雜交的原理，才有可能設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)進(jìn)程、才能有目的的進(jìn)行材料準(zhǔn)備，并能對實(shí)驗(yàn)結(jié)果作出預(yù)測與分析，尤其要對具體實(shí)驗(yàn)中各種選擇性壓力培養(yǎng)基的使用目的要十分清楚。大量的材料準(zhǔn)備、較長的實(shí)驗(yàn)流程是酵母雙雜交有別于其他實(shí)驗(yàn)的特點(diǎn)，而其操作技術(shù)本身并不十分困難。特別應(yīng)提出的是，一個陽性克隆的編號往往要被反復(fù)記錄多次，因此，要時時注意編號的正確性。另外，若從公司購得待篩選的酵母cDNA文庫，應(yīng)注意不同的公司有不同的產(chǎn)品，且各公司的產(chǎn)品不斷更新?lián)Q代，要認(rèn)真閱讀實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)手冊，以防出現(xiàn)失誤。

酵母雙雜交應(yīng)用

研究已知蛋白間的相互作用、尋找在蛋白—蛋白相互作用中起關(guān)鍵作用的結(jié)構(gòu)域、尋找與靶蛋白相互作用的新蛋白。相信隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展與推廣，酵母雙雜交技術(shù)在今后的蛋白質(zhì)組學(xué)研究中將發(fā)揮更大的作用。

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