腫瘤細(xì)胞遷移是惡性腫瘤最重要的特征之一，瘤細(xì)胞由其原發(fā)部位侵入血管或淋巴管或體腔，部分細(xì)胞被血液、淋巴液帶到另一部位或器官，在該處繁殖生長(zhǎng)，形成與原發(fā)瘤同樣類(lèi)型的腫瘤，這一過(guò)程即為腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移。

    目前檢測(cè)腫瘤細(xì)胞遷移的方法主要有細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)及Trans-Well小室遷移實(shí)驗(yàn)，傳統(tǒng)的細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)需要連續(xù)觀測(cè)以評(píng)估藥物對(duì)細(xì)胞遷移的作用，因此，其面臨的最大的問(wèn)題是不能保證每次觀察的都是同一位點(diǎn)，對(duì)結(jié)果不能進(jìn)行定量分析，也不能區(qū)分劃痕內(nèi)的細(xì)胞是遷移還是增殖的而來(lái)的。而Trans-Well小室遷移實(shí)驗(yàn)雖能定量檢測(cè)細(xì)胞遷移的數(shù)量，但不能直觀觀測(cè)細(xì)胞遷移過(guò)程，也不能將遷移和增殖細(xì)胞區(qū)分出來(lái)，而且其價(jià)格昂貴，不適合抗腫瘤細(xì)胞遷移藥物的大規(guī)模篩選。

細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)介紹

細(xì)胞遷移與侵襲實(shí)驗(yàn)將Transwell小室放入培養(yǎng)板中，小室內(nèi)稱(chēng)上室，培養(yǎng)板內(nèi)稱(chēng)下室，上下層培養(yǎng)液以聚碳酸酯膜相隔，將研究的細(xì)胞種在上室內(nèi)，由于聚碳酸酯膜有通透性，下層培養(yǎng)液中的成分可以影響到上室內(nèi)的細(xì)胞，應(yīng)用不同孔徑和經(jīng)過(guò)不同處理的聚碳酸酯膜，就可以進(jìn)行共培養(yǎng)、細(xì)胞趨化、細(xì)胞遷移、細(xì)胞侵襲等多種方面的研究。

    Transwell小室放入培養(yǎng)板中，小室內(nèi)稱(chēng)上室，培養(yǎng)板內(nèi)稱(chēng)下室，上室內(nèi)盛裝上層培養(yǎng)液，下室內(nèi)盛裝下層培養(yǎng)液，上下層培養(yǎng)液以聚碳酸酯膜相隔。我們將細(xì)胞種在上室內(nèi)，由于聚碳酸酯膜有通透性，下層培養(yǎng)液中的成分可以影響到上室內(nèi)的細(xì)胞，從而可以研究下層培養(yǎng)液中的成分對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)、運(yùn)動(dòng)等的影響。應(yīng)用不同孔徑和經(jīng)過(guò)不同處理的聚碳酸酯膜，就可以進(jìn)行共培養(yǎng)、細(xì)胞趨化、細(xì)胞遷移、細(xì)胞侵襲等多種方面的研究。

Transwell孔徑的選擇

※共培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)：在選擇膜孔徑的時(shí)候需要考慮實(shí)驗(yàn)的目的和實(shí)驗(yàn)細(xì)胞的大小，當(dāng)膜孔徑小于3μm的時(shí)候，細(xì)胞不會(huì)遷徙通過(guò)，所以如果不涉及研究細(xì)胞運(yùn)動(dòng)能力，應(yīng)選擇3μm以下的，通常是0.4μm或者3μm，例如在共培養(yǎng)體系研究細(xì)胞B分泌或代謝產(chǎn)物對(duì)細(xì)胞A的影響，就可以把A種在上室里，將B種在下室。
※趨化性實(shí)驗(yàn)：可用5.0、8.0、12.0μm膜，上室細(xì)胞可穿過(guò)聚碳酸酯膜進(jìn)入下室，計(jì)數(shù)進(jìn)入下室的細(xì)胞量可反映下室成分對(duì)上室細(xì)胞的趨化能力。
i.細(xì)胞B對(duì)細(xì)胞A的趨化作用：將細(xì)胞A種于上室，細(xì)胞B種于下室，可以研究細(xì)胞B分泌或代謝產(chǎn)生的物質(zhì)對(duì)細(xì)胞A的趨化作用。
ii.趨化因子對(duì)細(xì)胞的趨化作用：將細(xì)胞種于上室，下室加入某種趨化因子，可研究該趨化因子對(duì)細(xì)胞的趨化作用。

腫瘤細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)（transwell migration）

常用8.0μm（8μm孔徑的膜為文獻(xiàn)中用來(lái)做侵襲和轉(zhuǎn)移實(shí)驗(yàn)最常用的規(guī)格，本次訂購(gòu)的是Corning公司的用來(lái)做transwell migration的8μm孔徑的24孔板transwell insert以及用來(lái)做transwell invasion的BD公司的8μm的24孔板鋪膠transwell chamber）、12.0μm膜，上室種腫瘤細(xì)胞，下室加入FBS或某些特定的趨化因子，腫瘤細(xì)胞會(huì)向營(yíng)養(yǎng)成分高的下室跑，計(jì)數(shù)進(jìn)入下室的細(xì)胞量可反映腫瘤細(xì)胞的遷移能力。FBS是最常用的趨化因子，本實(shí)驗(yàn)也準(zhǔn)備選用FBS作為遷徙和侵襲實(shí)驗(yàn)的趨化因子。

腫瘤細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)（transwell invasion）

    常用8.0、12.0μm膜，原理與腫瘤細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)類(lèi)似，上室種腫瘤細(xì)胞，下室加入FBS或某些特定的趨化因子，腫瘤細(xì)胞會(huì)向營(yíng)養(yǎng)成分高的下室跑，但與腫瘤細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)不同的是，聚碳酸酯膜上室側(cè)鋪上一層基質(zhì)膠，用以模仿體內(nèi)細(xì)胞外基質(zhì)，細(xì)胞欲進(jìn)入下室，先要分泌基質(zhì)金屬蛋白酶（MMPs）將基質(zhì)膠降解，方可通過(guò)聚碳酸酯膜。計(jì)數(shù)進(jìn)入下室的細(xì)胞量可反映腫瘤細(xì)胞的侵襲能力。

細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)步驟

1、Transwell 小室的制備

    ※Corning公司的8μm孔徑無(wú)膠24孔板transwell insert

               i. 預(yù)平衡：在24孔板中和transwell小室中加入培養(yǎng)液，在37℃的培養(yǎng)箱里平衡一個(gè)小時(shí)或者過(guò)夜，這樣能夠增強(qiáng)細(xì)胞的粘附作用。

               ii. 正式使用：24孔板中加入含5-10%FBS的培養(yǎng)液0.6ml，將transwell inset 放入板中（用鑷子），在transwell insert中加入無(wú)血清的培液0.1ml。（操作手冊(cè)提示：實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，培液的高度需要定時(shí)的去觀察，當(dāng)需要維持要求高度的時(shí)候可以補(bǔ)加新鮮培液） 

    ※BD公司的8μm孔徑鋪有基層膠的24孔板transwell chamber

               i.再水化：從-20℃中取出并打開(kāi)包裝置于室溫，往transwell小室以及24孔板中各加入37℃的培液0.5ml，然后置于37℃，5%CO₂培養(yǎng)箱中孵育2h使得基質(zhì)膠再水化。

               ii.再水化后：小心的將培液吸走，注意別觸到基質(zhì)膠。

2、制備細(xì)胞懸液

            i. 制備細(xì)胞懸液前可先讓細(xì)胞撤血清饑餓12－24h，進(jìn)一步去除血清的影響。但這一步并不是必須的。

            ii. 消化細(xì)胞，終止消化后離心棄去培養(yǎng)液，用PBS洗1－2遍，用含BSA的無(wú)血清培養(yǎng)基重懸。調(diào)整細(xì)胞密度至1－5×10⁵個(gè)/ml，具體的細(xì)胞密度需進(jìn)行預(yù)實(shí)驗(yàn)，migration與invasion的細(xì)胞密度也有所不同（細(xì)胞量過(guò)多，穿過(guò)膜的細(xì)胞會(huì)過(guò)多過(guò)快，如果最后用計(jì)數(shù)法統(tǒng)計(jì)結(jié)果的話(huà)將難以計(jì)數(shù)；而過(guò)少的話(huà)，可能還沒(méi)到檢測(cè)的時(shí)間點(diǎn)，所有的細(xì)胞都已穿過(guò)，因此最少也要保證在收樣的時(shí)候，上室內(nèi)還要有一定量的細(xì)胞存在。）

3、接種細(xì)胞

          i. 取細(xì)胞懸液體積V1加入Transwell小室，不同規(guī)格Transwell小室對(duì)細(xì)胞懸液量有不同要求，參考說(shuō)明書(shū)。Corning公司24孔板transwell insert中加入的體積為0.1ml，BD公司的鋪膠24孔板transwell insert中加入的體積為0.5ml。

          ii.24孔板下室一般加入體積V2含F(xiàn)BS的培養(yǎng)基（FBS濃度需進(jìn)行預(yù)實(shí)驗(yàn)），不同的培養(yǎng)板加的量有不同要求，具體請(qǐng)參考說(shuō)明書(shū)。特別注意：下層培養(yǎng)液和小室間常會(huì)有氣泡產(chǎn)生，一旦產(chǎn)生氣泡，下層培養(yǎng)液的趨化作用就減弱甚至消失了，在種板的時(shí)候要特別留心，一旦出現(xiàn)氣泡，要將小室提起，去除氣泡，再將小室放進(jìn)培養(yǎng)板。

          iii. 常規(guī)培養(yǎng)12－48h，時(shí)間點(diǎn)的選擇需考慮到細(xì)胞侵襲能力、趨化因素和細(xì)胞數(shù)目等。

          iv.  注意事項(xiàng)

       l  需要考慮轉(zhuǎn)oligo之后與NC相比，會(huì)不會(huì)對(duì)細(xì)胞的增值以及凋亡產(chǎn)生影響，如果轉(zhuǎn)oligo后能抑制細(xì)胞增值以及促進(jìn)細(xì)胞凋亡的話(huà)，那需要關(guān)注MDA-231侵襲能力的下降是因?yàn)榧?xì)胞數(shù)目的減少還是因?yàn)榇_實(shí)轉(zhuǎn)移和侵襲能力下調(diào)了（是否需要加一個(gè)什么都不轉(zhuǎn)的對(duì)照組?）

    l  時(shí)間過(guò)長(zhǎng)不可以，同樣，過(guò)短也不行，因?yàn)榧?xì)胞內(nèi)會(huì)有一定量的MMPs儲(chǔ)存，短時(shí)間內(nèi)可能侵襲能力不會(huì)有太大改變。同時(shí)從oligo的轉(zhuǎn)入到進(jìn)而發(fā)揮作用，影響MMPs表達(dá)，到最后釋放到培養(yǎng)基中，還需要一個(gè)過(guò)程，所以時(shí)間太短效應(yīng)不明顯，但是時(shí)間的延長(zhǎng)不能影響到細(xì)胞增值的改變。

    l  細(xì)胞在小室內(nèi)的形態(tài)有可能不是正常培養(yǎng)貼壁的形態(tài)，而是圓形的，仍是懸浮時(shí)的形態(tài)，不過(guò)會(huì)聚集成團(tuán)，屬正常現(xiàn)象（別人的經(jīng)驗(yàn)，注意觀察）

    l  在培養(yǎng)過(guò)程中，膜下會(huì)逐漸有少量小氣泡產(chǎn)生，這是正?，F(xiàn)象，可不予處理，但如果出現(xiàn)了大氣泡，一定要去除，否則嚴(yán)重影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果。最好接種細(xì)胞后1－2h把培養(yǎng)板從培養(yǎng)箱里拿出來(lái)看看，確信沒(méi)有大氣泡產(chǎn)生。

4、結(jié)果統(tǒng)計(jì)

    ※去除基層膠和未侵襲出膠的細(xì)胞（參照BD公司的操作手冊(cè)）

          i.  去除transwell小室中的培養(yǎng)液

          ii. 用干凈的濕棉簽，輕柔地但是均一用力擦除小室膜上表面的基質(zhì)膠以及未侵襲出膠的細(xì)胞（invasion），或者擦除未轉(zhuǎn)移跨膜的細(xì)胞（migration）。

          iii.  用第二根濕棉簽重復(fù)一次

注意：整個(gè)過(guò)程應(yīng)該盡量快的完成，以免膜下表面的細(xì)胞干掉。

    ※細(xì)胞固定與染色

          i. 結(jié)晶紫染色法：先固定后染色，各文獻(xiàn)中固定方法不一，大致有以下幾種:100%甲醇固定10min、4%的多聚甲醛固定15min或者100%乙醇固定10min。固定完之后用0.1%的結(jié)晶紫染色染30min。該方法為文獻(xiàn)中最常用的方法（訂購(gòu)結(jié)晶紫試劑）

          ii. 瑞氏染色法：同樣是先固定，可以選用100%甲醇固定10min，隨后用瑞氏染液即A液一倍體積混合B液2倍體積后染色相應(yīng)時(shí)間。該染色方法文獻(xiàn)中使用較少，所以染色時(shí)間有待摸索，根據(jù)小趙師兄之前的經(jīng)驗(yàn)應(yīng)該在20分鐘以上。

          iii. 使用BD公司的Diff-Quik staining kit：這個(gè)方法文獻(xiàn)中也有使用，操作步驟嚴(yán)格按照BD公司的使用手冊(cè)，但是須購(gòu)買(mǎi)BD公司kit，較貴。

    ※ 細(xì)胞計(jì)數(shù)

         i.用鋒利的刀片將膜從小室中分離下來(lái)，具體是先將刀尖插入膜與小室的邊緣處形成一個(gè)小口，然后讓小室逆著刀口的方向旋轉(zhuǎn)，這樣膜就被分離開(kāi)來(lái)，當(dāng)剩下少許連接的時(shí)候用鑷子以盡量少的接觸面積夾在膜上，最終將剩余的膜分離。

         ii.事先準(zhǔn)備好一塊載玻片，在上面滴一滴油，將分割下來(lái)的膜有細(xì)胞面朝上用鑷子置于油上，隨后再在膜上滴加一滴油，蓋好蓋玻片后，置于顯微鏡下拍照計(jì)數(shù)。

注：細(xì)胞計(jì)數(shù)可以用顯微照相裝置拍下幾個(gè)具有代表性的視野然后進(jìn)行計(jì)數(shù)，也可以直接在顯微鏡下計(jì)數(shù)，前者較優(yōu)。

以上是關(guān)于細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)服務(wù)、細(xì)胞遷移和侵襲實(shí)驗(yàn)的內(nèi)容，內(nèi)容來(lái)源于美迪西官網(wǎng)。

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