熒光原位雜交可用來檢測細(xì)胞內(nèi)特定的DNA或RNA，從而判斷特定基因的表達(dá)和定位，也可用來檢測腫瘤或其他疾病發(fā)生或進(jìn)行中的染色體的改變。

FISH（Fluoresence In Situ Hybridization）技術(shù)是80年代開始發(fā)展起來的一種新的定位技術(shù)。在人類基因組研究中得到了廣泛的應(yīng)用．通過中期染色體的FISH可以進(jìn)行SCP，Cosmid和YAC的染色體定位，嵌合克隆的鑒別，通過間期核的FISH可以在50kb的分辨率下進(jìn)行基因作圖，最新的研究進(jìn)展已可以進(jìn)行伸展的染色質(zhì)絲(chromatin fibre)的FISH，直接測量基因的長度、從而達(dá)到高精度基因作圖的目的。隨著FISH技術(shù)發(fā)展，它將在人類以及其它物種基因組研究中發(fā)揮更大的作用。

熒光標(biāo)記的染色體原位雜交技術(shù)提供了一種快速而有效的手段，將DNA片段和特定的真核生物細(xì)胞的染色體區(qū)帶聯(lián)系了起來，并將這些DNA片段排序，這是研究DNA順序在染色體上位置的最直接的方法。

探針標(biāo)記時(shí)可采用兩種基本方式：

（1）直接標(biāo)記法：將熒光分子直接標(biāo)記于探針DNA／RNA上，雜交后可直接在熒光顯微鏡下檢測。這種方式快速簡捷，由于雜交信號較弱、且不能進(jìn)一步放大，以前這種方法用得不多，但它有背景少的優(yōu)點(diǎn)，近來在一些公司的試劑盒中得到應(yīng)用。

（2）間接標(biāo)記法：常用的間接法是將一些類似于半抗原(hapten)的標(biāo)記分子摻入探針分子中。用的較多的試劑有生物素，地谷新(digoxigenin)，二硝基苯(dinitrophenyl，DNP)，氨基乙酰茐(aminoacetylfuorene，AAF)，汞和磺酸鹽(sulfonate)。就摻入方式來說，生物素，地谷新等是以核苷酸衍生物的形式摻入的，可用切口平移法來進(jìn)行。現(xiàn)在更多的人開始用隨機(jī)引物法。用這兩種方法標(biāo)記好的探針大小在200一500bp范圍內(nèi)，是用于雜交的最佳大小。另外，也可以在已知順序的兩個(gè)引物之間用PCR法來擴(kuò)增，或從合適的載體上通過RNA轉(zhuǎn)錄而來。

1、原理

FISH技術(shù)是一種重要的非放射性原位雜交技術(shù)。它的基本原理是:利用已知核酸序列作為探針，以熒光素直接標(biāo)記或以非放射性物質(zhì)標(biāo)記后與靶DNA進(jìn)行雜交，再通過免疫細(xì)胞化學(xué)過程連接上熒光素標(biāo)記物，最后在熒光顯微鏡下觀察雜交信號，從而對標(biāo)本待測核酸進(jìn)行定量、定性及定位分析。

2、實(shí)驗(yàn)流程

FISH樣本的制備→探針的制備→探針標(biāo)記→雜交→染色體顯帶→熒光顯微鏡檢測→結(jié)果分析。

3、特點(diǎn)

原位雜交的探針按標(biāo)記分子類型分為放射性標(biāo)記和非放射性標(biāo)記。用同位素標(biāo)記的放射性探針優(yōu)勢在于對制備樣品的要求不高，可以通過延長曝光時(shí)間加強(qiáng)信號強(qiáng)度，故較靈敏。缺點(diǎn)是探針不穩(wěn)定、自顯影時(shí)間長、放射線的散射使得空間分辨率不高、及同位素操作較繁瑣等。采用熒光標(biāo)記系統(tǒng)則可克服這些不足，這就是FISH技術(shù)。FISH技術(shù)作為非放射性檢測體系，具有以下優(yōu)點(diǎn):

首先，從探針的制備雜交來看，生物素和其他標(biāo)記分子沒有放射性，標(biāo)記過程和雜交過程沒有污染的危險(xiǎn)，比較安全。而且用生物素或其他的標(biāo)記分子標(biāo)記好以后的探針分子相當(dāng)穩(wěn)定，沒有半衰期的限制，可以長期保存。熒光顯色時(shí)間短，不象同位素雜交那樣要求長時(shí)間曝光，背景簡單。靈敏度也毫不遜色。

另外，F(xiàn)ISH可以用多種顏色同時(shí)顯色，這是同位素雜交不可比擬的。這種多色作圖，可以便染色體分帶和探針信號顯不同的顏色而同時(shí)觀察；也可以用不同熒光標(biāo)記不同的探針，以確定探針在染色體上酌相對位置。

缺點(diǎn)：不能達(dá)到100%雜交，特別是在應(yīng)用較短的cDNA探針時(shí)效率明顯下降。

4、應(yīng)用

該技術(shù)不但可用于已知基因或序列的染色體定位，而且也可用于未克隆基因或遺傳標(biāo)記及染色體畸變的研究。在基因定性、定量、整合、表達(dá)等方面的研究中頗具優(yōu)勢。

I．染色體結(jié)構(gòu)變異與非整倍體的檢測:熒光原位雜交簡化了染色體結(jié)構(gòu)變異的檢測。利用原位雜交可比較容易地檢測出缺失、 附加或替換的染色體。

II．基因擴(kuò)增和缺失的測:FISH空間分辨率和敏感性使得親本和擴(kuò)增基因在抗病蟲害細(xì)胞中定位成為可能。同時(shí)用FISH可定位轉(zhuǎn)基因植物中外源基因位置和拷貝數(shù),此法在番茄、煙草、大麥、小麥、黑麥等作物中已獲成功。利用 FISH 技術(shù)也 可檢測一些與遺傳性疾病相關(guān)的基因缺失 ,如成功檢測了 aniridia 疾病(一種虹膜缺失的罕見遺傳異常疾病)患者的缺失基因。

III．FISH 技術(shù)為著絲粒結(jié)構(gòu)研究提供了重要手段。同時(shí)應(yīng)用 FISH 技術(shù)可直接觀察染色體端粒 ,這簡化了染色體在核內(nèi)的結(jié)構(gòu)和功能研究。

IV．基因作圖:用 FISH 技術(shù)可直接檢測 DNA 在染色體上的位置 ,所確定位置是基因在染色體上實(shí)際的物理位置。由于原位雜交不受位點(diǎn)內(nèi)變異和位點(diǎn)間拷貝數(shù)的影響,FISH 技術(shù)已成為重復(fù)序列和多基因家族作圖的重要手段。

V．染色體RNA和基因組進(jìn)化研究:染色體的主要成分包括DNA和組蛋白,除此之外，還有非組蛋白和RNA。對這些物質(zhì)在染色體中分布進(jìn)行精確定位是研究染色體高級結(jié)構(gòu)和構(gòu)建染色體模型的關(guān)鍵所在。FISH 技術(shù)為上述研究提供了有效手段。

熒光原位雜交技術(shù)主要應(yīng)用于以下領(lǐng)域：

細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄譜分析

·體內(nèi)外 RNAi 傳遞和基因敲除

·生物標(biāo)記物研究

·報(bào)告基因篩選

·分子病理學(xué)

·干細(xì)胞分化

·細(xì)胞生物學(xué)

·神經(jīng)生物學(xué)

隨著標(biāo)記手段、檢測試劑以及熒光觀察等技術(shù)的發(fā)展，染色體FISH的應(yīng)用范圍在不斷拓寬，激光共執(zhí)聚焦顯微技術(shù)的發(fā)展，使得核的三維重建可以在計(jì)算機(jī)的輔助下得以實(shí)現(xiàn)。染色體FISH不僅可用來定位基因，而且可用以研究基因在間核中的位置。

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