2023年3月24號(hào)，美迪西生化學(xué)部高級(jí)副總裁馬興泉博士在IDC2023第四屆化學(xué)新藥與改良型新藥研發(fā)論壇中做了主題為《小核酸藥物研發(fā)中的藥物化學(xué)》的報(bào)告。

嘉賓介紹

馬興泉 博士 美迪西化學(xué)部高級(jí)副總裁

中國(guó)科學(xué)院上海有機(jī)化學(xué)研究所生命有機(jī)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室獲得博士學(xué)位，美國(guó)國(guó)家衛(wèi)生研究總署(NIH)訪問(wèn)學(xué)者，曾擔(dān)任美國(guó)斯克利普斯研究所（TSRI） 副研究員。擁有20多年企業(yè)藥物研發(fā)經(jīng)驗(yàn)。馬博士背景是糖化學(xué)，在糖化學(xué)與生物學(xué)領(lǐng)域有較為廣泛的研究，對(duì)中草藥活性成分皂甙的分離、提取以及化學(xué)合成積累了較為豐富的知識(shí)和經(jīng)驗(yàn)，對(duì)前沿領(lǐng)域的多糖大分子綴合物例如糖脂、糖肽、糖蛋白的合成以及生物活性有多年的研究與積累。在國(guó)內(nèi)外核心期刊發(fā)表20多篇學(xué)術(shù)論文，包括JACS, ANGEW, LANGMUIR, OBC, JMCL等。馬博士2018年加入美迪西，搭建南匯研發(fā)中心團(tuán)隊(duì)，領(lǐng)銜創(chuàng)建了美迪西PROTAC、ADC、小核酸等藥物研發(fā)平臺(tái)， 對(duì)多個(gè)前沿藥物研發(fā)領(lǐng)域有深入的鉆研和見(jiàn)解。

01 小核酸藥物的歷史

小核酸藥物的發(fā)展基于1940年DNA的發(fā)現(xiàn)，在這八十多年的時(shí)間里有以下幾個(gè)關(guān)鍵的節(jié)點(diǎn)：

1998年FDA批準(zhǔn)了首款A(yù)SO藥物Fomivirsen，用于治療巨細(xì)胞病毒(CMV)視網(wǎng)膜炎；

2004年全球首款核酸適配體藥物Macugen獲批上市，靶向VEGFR，用于治療老年濕性黃斑變性；

2018年全球首款 siRNA藥物Onpattro (Patisiran)由FDA批準(zhǔn)上市,用于由 hATTR 引起的多發(fā)性神經(jīng)病患者的治療。

可以看到小核酸藥物的發(fā)展歷史稱得上厚積薄發(fā)，而且最近小核酸藥物的火熱已經(jīng)超出了PROTAC和ADC，成為藥物研發(fā)屆的新寵兒。因?yàn)樾『怂崴幬锏臋C(jī)制是在遺傳物質(zhì)的根本層面解決問(wèn)題，這一點(diǎn)對(duì)比傳統(tǒng)小分子藥物和抗體藥物具有巨大的優(yōu)勢(shì)，所以隨著對(duì)小核酸藥物的開(kāi)發(fā)不斷深入，未來(lái)會(huì)有更多的曾經(jīng)認(rèn)為不可成藥的靶點(diǎn)被攻克。

02 小核酸藥物的研發(fā)核心是藥物化學(xué)

小核酸藥物包括siRNA, miRNA, Antisense oligo, CpG oligo, Aptamer等，其藥物研發(fā)過(guò)程并不像我們想象的那么復(fù)雜，它其實(shí)是一個(gè)很簡(jiǎn)單直觀的皆是可以通過(guò)藥物化學(xué)方法合成的化學(xué)藥物，所以小核酸藥物的藥物研發(fā)主要圍繞化學(xué)合成和化學(xué)修飾這兩個(gè)重心。

截至目前，已經(jīng)有16款小核酸藥物獲批上市，主要以ASO為主，但近幾年siRNA的數(shù)量有增加趨勢(shì)，其中肝靶向的小核酸藥物比較多，應(yīng)用范圍也更廣泛。

第一個(gè)小核酸藥物Fomivirsen，也就是之前說(shuō)的1998年的第一個(gè)ASO藥物，與天然核苷酸相比，對(duì)2位的羥基進(jìn)行了脫氧，用硫取代了磷酸上的氧，這就是小核酸藥物中最基礎(chǔ)的化學(xué)修飾，被稱為第一代化學(xué)修飾的磷酸骨架修飾。

2004年的第一個(gè)適配體藥物Pegaptanib在核糖上加了一個(gè)甲氧基。

2016年獲批上市的PMO藥物Eteplirsen中用以連接的磷酸修飾成了磷-氮，與之類似的PMO已經(jīng)有3個(gè)獲批上市

2018年獲批上市的Patisiran是第8個(gè)成功上市的核酸藥物，也是第一個(gè)siRNA，由于它是雙鏈的RNA結(jié)構(gòu)，所以化學(xué)結(jié)構(gòu)上明顯比ASO和PMO要復(fù)雜得多。

在這段時(shí)間里，除了siRNA橫空出世，用乙二醇對(duì)單體進(jìn)行修飾改造的小核酸藥物上市比較集中，這也是第二代化學(xué)修飾。

2019年的Givosiran是第一個(gè)用到GalNAc遞送系統(tǒng)的siRNA，對(duì)于整個(gè)核酸藥物的研發(fā)具有劃時(shí)代的意義。不同于之前LNP脂質(zhì)體遞送系統(tǒng)，GalNAc的三個(gè)氨基半乳糖顯示出了高度的選擇性和靶向性，在肝臟中具有靶點(diǎn)特異性。

目前還有一種在研的是cEt Containing Gapmer，結(jié)構(gòu)比較復(fù)雜，仍處在探索研究階段。

對(duì)小核酸藥物進(jìn)行化學(xué)修飾有利于提高藥物的穩(wěn)定性、利用度，甚至對(duì)藥效藥代也有提升。隨著對(duì)化學(xué)修飾技術(shù)的更新?lián)Q代，小核酸藥物的藥物活性也得到了不斷地提升，主要體現(xiàn)在給藥頻率和劑量上。

03 核酸藥物的遞送系統(tǒng)

現(xiàn)在遞送系統(tǒng)的種類也越來(lái)越多，這里統(tǒng)計(jì)展示了9種遞送系統(tǒng)：

這里很多種類型還沒(méi)有經(jīng)過(guò)市場(chǎng)的成功檢驗(yàn)，像第三種用抗體橋接做siRNA的遞送系統(tǒng)目前還沒(méi)有上市的藥物，但已經(jīng)有很多人在研究了。我們重點(diǎn)還是講講LNP和GalNAc。

LNP在人體內(nèi)具有免疫原性且為改變性狀的脂質(zhì)體不能靶向遞送藥物，LNP中膽固醇占比較大，因?yàn)槲⒂^結(jié)構(gòu)上看，膽固醇的骨架大，水溶性比較弱，能撐起球形、盤型的結(jié)構(gòu)。

GalNAc不表現(xiàn)出免疫原性，所以更加安全。GalNAc靶向肝細(xì)胞上的ASGPR位點(diǎn)，可通過(guò)內(nèi)吞作用被吸收，副作用更小。

04 美迪西核酸藥物研發(fā)經(jīng)驗(yàn)

美迪西核酸藥物研發(fā)服務(wù)平臺(tái)是集成了藥物發(fā)現(xiàn)、生產(chǎn)和臨床前研究的一體化綜合性平臺(tái)，可以完成核酸藥物的化學(xué)合成和修飾、體內(nèi)外pkpd的檢測(cè)。經(jīng)過(guò)將近4年的研發(fā)歷程，美迪西核酸藥物研發(fā)服務(wù)平臺(tái)積累了豐富的經(jīng)驗(yàn)，目前有超過(guò)10個(gè)的on going項(xiàng)目，超過(guò)50個(gè)致力于核酸藥物研發(fā)的化學(xué)家組成科研團(tuán)隊(duì)，構(gòu)建了超過(guò)100個(gè)可使用的單體。

基于嚴(yán)謹(jǐn)?shù)目茖W(xué)態(tài)度、開(kāi)放的技術(shù)平臺(tái)、豐富的研發(fā)經(jīng)驗(yàn)和先進(jìn)的儀器設(shè)備，我們可以滿足行業(yè)對(duì)于前沿創(chuàng)新核酸藥物的研發(fā)需求

05 寡核苷酸化學(xué)合成的流程

總體來(lái)說(shuō)，每新增一個(gè)堿基需要經(jīng)歷一下4個(gè)步驟：DET、CPL、CAP、OXI。

1. 脫保護(hù)（Deprotection, DET）：將預(yù)先連接在固相載體CPG上的活性基團(tuán)被保護(hù)的核苷酸與三氯乙酸反應(yīng)，脫去其5'-羥基的保護(hù)基團(tuán)DMT，獲得游離的5'-羥基；

2. 縮合連接（Coupling, CPL）：將亞磷酰胺保護(hù)核苷酸單體與活化劑四氮唑混合，得到核苷亞磷酸活化中間體，與溶液中游離的5'-羥基發(fā)生縮合反應(yīng)；

3. 加帽反應(yīng)（Capping，CAP）：縮合反應(yīng)中可能有極少數(shù)5'-羥基沒(méi)有參加反應(yīng)(少于2%)，可用乙酸酐和1-甲基咪唑終止合成，這種短片段可以在純化時(shí)分離掉；

4. 氧化穩(wěn)定（Oxidation, OXI）：在氧化劑的作用下，亞磷酰形式轉(zhuǎn)變?yōu)楦€(wěn)定的磷酸三酯，使DNA磷酸骨架更穩(wěn)定。

重復(fù)以上循環(huán)直到需要合成的堿基全部連接完成，然后進(jìn)入Ammonolysis氨解反應(yīng)。

氨解反應(yīng)通過(guò)不同的儀器也有兩種反應(yīng)，一種是氣相的，一種是液相的。氨解后需要進(jìn)行凍干或者超離心，用去離子水洗滌，再進(jìn)行分析和純化。注意，在這些步驟里，水的含量需要重點(diǎn)關(guān)注。因?yàn)樗暮咳绻^(guò)高，容易發(fā)生副反應(yīng)，對(duì)于結(jié)果會(huì)產(chǎn)生不良影響。

對(duì)于寡核苷酸的分析美迪西主要使用UPLC和HPLC這兩種儀器。HPLC的檢測(cè)結(jié)果純度一般可以達(dá)到80%以上，UPLC和QTOF聯(lián)用檢測(cè)的純度也是80%以上。這里我們可以看到試驗(yàn)結(jié)果的峰值圖譜，一般小于500 ppm的結(jié)果都是準(zhǔn)確的。

純化會(huì)用到制備HPLC，純化后核酸藥物樣品的濃度能達(dá)到98%以上。第二種方法是是用AEX HPLC，陰離子交換高效液相色譜純化的寡核苷酸必須沒(méi)有多余的鹽，這一點(diǎn)很容易通過(guò)使用脫鹽柱實(shí)現(xiàn)。

這是一個(gè)合成siRNA的例子：

可以看到經(jīng)過(guò)制備HPLC純化后siRNA的純度達(dá)到了92%，圖譜上的峰型沒(méi)有那么鋒利，事實(shí)上這跟最左邊5’上的磷-硫鍵有關(guān)，可能出現(xiàn)的手性結(jié)構(gòu)導(dǎo)致數(shù)據(jù)的結(jié)果不完美。

06 美迪西核酸藥物研發(fā)服務(wù)平臺(tái)

美迪西可以提供單體合成、修飾；寡核苷酸合成；遞送系統(tǒng)合成以及寡核苷酸偶聯(lián)物的合成。已經(jīng)建成的siRNA庫(kù)，不僅有豐富的單體庫(kù)存，而且擁有龐大的單體合成砌塊庫(kù)，可以快速完成各類修飾單體的合成。美迪西擁有專業(yè)的小核酸藥物的研發(fā)團(tuán)隊(duì)可以提供高效快捷地研發(fā)服務(wù)；已有多個(gè)siRNA藥物FTE項(xiàng)目完成和進(jìn)行中。

在生物活性評(píng)價(jià)服務(wù)上可以進(jìn)行：

1. siRNA-GALNAc與靶向肝細(xì)胞的結(jié)合評(píng)估（ELISA,SPR,FP,FACS,MSD,Confocal 顯微鏡）

2. 靶標(biāo)mRNA/蛋白質(zhì)水平降低評(píng)估（RT/Q-PCR,Western blot)

3. 細(xì)胞表型和功能性干擾的評(píng)估（細(xì)胞增殖，遷移，蛋白質(zhì)修飾和互作）

4. 脫靶效應(yīng)評(píng)估

07 小結(jié)

核酸藥物作為繼小分子化藥和抗體藥物后的第三大類型藥物，在全球已經(jīng)形成燎原之勢(shì)，發(fā)展勢(shì)頭迅猛，成為生物醫(yī)藥企業(yè)研發(fā)的重點(diǎn)和熱點(diǎn)。

核酸藥物研發(fā)速度極快，靶向性高，有望突破傳統(tǒng)藥物無(wú)法解決的“不可成藥”的靶點(diǎn)。在研發(fā)過(guò)程中，藥物化學(xué)是核心和重點(diǎn)。

美迪西核酸藥物研發(fā)服務(wù)平臺(tái)擁有豐富的核酸藥物研發(fā)經(jīng)驗(yàn)，可以快速完成各類修飾單體的合成，制定開(kāi)發(fā)路線，滿足行業(yè)對(duì)于前沿創(chuàng)新核酸藥物的研發(fā)需求，為醫(yī)藥公司及科研單位提供核酸藥物發(fā)現(xiàn)、篩選及臨床前研究服務(wù)。

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