摘要

現(xiàn)代離子色譜（Ion Chromatography）技術(shù)起源于上世紀(jì)70年代，它的開始源于H.Small及其合作者的工作。離子色譜是高效液相的一種，是分析陰、陽離子、小分子極性有機(jī)物（酸堿）等的一種液相色譜。離子色譜在藥物分析中的應(yīng)用補(bǔ)充了液相色譜和氣相色譜對(duì)離子型藥物分析的不足，可用做離子化合物及其雜質(zhì)的定性與定量研究，已成為藥物質(zhì)量研究與質(zhì)量控制的手段之一。

在實(shí)際的方法開發(fā)與應(yīng)用中離子色譜可以連接多種類型的檢測器，例如電導(dǎo)檢測器、電荷檢測器、安培檢測器和光學(xué)檢測器等^[1]。其具有靈敏、快速、準(zhǔn)確度高和選擇多樣性的有點(diǎn)，逐漸獲得了很多研究人員和技術(shù)人員的青睞，其被廣泛應(yīng)用到環(huán)境、食品、飲料、工業(yè)、醫(yī)療衛(wèi)生、藥物研發(fā)、化工、電子、生命科學(xué)和農(nóng)業(yè)等領(lǐng)域。

關(guān)鍵詞：離子色譜；藥物質(zhì)量研究；定性與定量分析

在藥物研究的過程中，離子色譜常用作對(duì)離子型化合物的分析和定量研究。離子化合物，是由陰離子（Anion，帶負(fù)電）和陽離子（Cation，帶正電）組成，其本質(zhì)上是庫侖力的離子鍵相結(jié)合的化合物。離子化合物通常熔點(diǎn)和沸點(diǎn)較高，熔融時(shí)或電離產(chǎn)生其組成離子的水溶液中時(shí)能導(dǎo)電。大部分離子化合物在常溫下是固體。

對(duì)于適用于離子色譜檢測的常見類型陽離子，主要包括第一主族和第二主族的堿金屬和堿土金屬和部分的過度金屬元素，活潑金屬離子（如鋰鈉離子、鉀離子、鈣離子、鎂離子等）；常見類型陰離子，主要包括鹵素離子、有機(jī)和無機(jī)酸根離子（如氟離子、氯離子、溴離子、碘離子、甲酸根、三氟乙酸根、硝酸根和硫酸根等），其在水溶液條件下可導(dǎo)電，其常用電導(dǎo)檢測器原理為可連續(xù)檢測流出物的電導(dǎo)變化。

01 離子色譜的基本組成

01 進(jìn)樣系統(tǒng)

進(jìn)樣器是是將樣品送入色譜柱的裝置，是離子色譜儀進(jìn)行化合物分析的重要組成部分。自動(dòng)進(jìn)樣器包括進(jìn)樣臂、進(jìn)樣針、樣品盤、清洗系統(tǒng)、驅(qū)動(dòng)系統(tǒng)以及控制系統(tǒng)等部分組成，各個(gè)部分之間緊密合作，共同帶動(dòng)著自動(dòng)進(jìn)樣器的正常運(yùn)行。特別說明進(jìn)樣針為PEEK材質(zhì)，具有耐腐蝕等優(yōu)點(diǎn)，但材質(zhì)較為脆弱，樣品瓶蓋需使用預(yù)開口蓋。

02 泵模塊

輸液泵為離子色譜儀提供動(dòng)力，是液相的核心部件。根據(jù)泵的工作原理又可以分為串聯(lián)式雙柱塞往復(fù)泵、并聯(lián)式雙柱塞往復(fù)泵和單柱塞往復(fù)泵，材質(zhì)為耐壓耐腐蝕的PEEK材料（色譜柱正常使用壓力一般小于20MPa），具有輸出壓力高、耐腐蝕、流量穩(wěn)定、噪音低等優(yōu)點(diǎn)。

03 淋洗液發(fā)生系統(tǒng)

生成淋洗液（流動(dòng)相）的關(guān)鍵模塊，區(qū)別于液相色譜的專有模塊，常用陰離子檢測發(fā)生罐為氫氧化鉀淋洗液發(fā)聲罐；常用陽離子檢測發(fā)生罐為甲基磺酸淋洗液發(fā)生罐，為電解池原理，通過控制電流大小而得到相應(yīng)濃度的淋洗液系統(tǒng)。優(yōu)點(diǎn)是所得淋洗液潔凈度高、對(duì)背景影響小、濃度準(zhǔn)確、無需人為配制淋洗液。

04 抑制系統(tǒng)

抑制系統(tǒng)是離子色譜的核心部件之一，主要作用是降低背景電導(dǎo)和提高檢測靈敏度。抑制器的好壞關(guān)系到離子色譜的基線穩(wěn)定性、重現(xiàn)性和靈敏度等關(guān)鍵指標(biāo)。

① 柱－膠抑制：采用固定短柱或現(xiàn)場填充抑制膠進(jìn)行抑制，不同的抑制柱交替使用，屬于間歇式抑制。
② 離子交換膜抑制：采用離子交換膜，利用離子濃度滲透的原理進(jìn)行抑制。需要配制硫酸再生液，系統(tǒng)需要配置氮?dú)饣騽?dòng)力裝置。
③ 電解自再生膜抑制：利用電解水產(chǎn)生媒介離子和離子配合離子交換膜進(jìn)行抑制（最佳選擇）。

05 分離及檢測系統(tǒng)

分離系統(tǒng)是色譜體系的重要模塊，其使用色譜柱常包括兩部分組成。

① 保護(hù)柱：保護(hù)柱與分析柱填料相同，消除樣品中可能損壞分析住填料的雜質(zhì)。如果不一致，會(huì)導(dǎo)致死體積增大、峰擴(kuò)散和分離度差等。
② 分析柱：分離樣品組分。離子色譜常用分離模式有三種，分別是離子交換色譜、離子排斥色譜和離子對(duì)色譜[2]。

檢測系統(tǒng)由抑制器和檢測器兩部分組成，抑制器的主要作用是通過電解抑制或化學(xué)抑制的方式降低檢測背景值，提高待測離子的響應(yīng)：

① 檢測器主要為電導(dǎo)檢測器，是通過測定溶液流過電導(dǎo)池電極時(shí)的電導(dǎo)率，電導(dǎo)率越大，電阻率越小，電阻率與電阻成正比，電阻越小電流值越大，電導(dǎo)檢測器是基于極限摩爾電導(dǎo)率應(yīng)用的檢測器，主要用于檢測無機(jī)陰陽離子、有機(jī)酸和有機(jī)胺等；
② 另一種檢測器為安培檢測器，安培檢測器是基于測量電解電流大小為基礎(chǔ)的檢測器，主要用于檢測具有氧化還原特性的物質(zhì)，安培檢測器分為主適用于抗壞血酸、溴、碘、氰、酚、硫化物、亞硫酸鹽、兒茶酚胺、芳香族硝基化合物、芳香胺、尿酸和對(duì)二苯酚等物質(zhì)的檢測的直流安培檢測器、適用于醇類、醛類、糖類、胺類（一二三元胺，包括氨基酸）、有機(jī)硫、硫醇、硫醚和硫脲等物質(zhì)的檢測用于醇類、醛類、糖類、胺類（一二三元胺，包括氨基酸）、有機(jī)硫、硫醇、硫醚和硫脲等物質(zhì)的檢測的脈沖安培檢測器以及在脈沖安培檢測器基礎(chǔ)上升級(jí)的積分安培檢測器。

06 離子色譜儀的管道系統(tǒng)

管道材料有PEEK管（高壓區(qū)）、PTFE管、硅膠管（氣路或廢液用）、各種接頭和連接配件。

02 離子色譜儀的工作流程

高壓輸液泵將流動(dòng)相以穩(wěn)定的流速（或壓力）輸送至分析體系，在色譜柱之前通過進(jìn)樣器將樣品導(dǎo)入，流動(dòng)相將樣品帶入色譜柱，在色譜柱中各組分被分離，并依次隨流動(dòng)相流至檢測器。

抑制型離子色譜則在電導(dǎo)檢測器之前增加一個(gè)抑制系統(tǒng)，即用另一個(gè)高壓輸液泵將再生液輸送到抑制器。在抑制器中，流動(dòng)相背景電導(dǎo)被降低，然后將流動(dòng)出物導(dǎo)入電導(dǎo)池，檢測到的信號(hào)送至數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)記錄、處理或保存。

03 離子色譜的基本流路

04 離子色譜電解抑制器的抑制原理

在離子色譜的抑制法分析過程中，使用的淋洗液是強(qiáng)電解質(zhì)，在不使用抑制器的情況下，背景電導(dǎo)高，靈敏度差。

以陰離子分析為例，陰離子抑制器的作用是將高電導(dǎo)的淋洗液轉(zhuǎn)變成為低電導(dǎo)的弱酸或水，從而提高檢測的靈敏度。比如常用的淋洗液是Na2CO3-NaHCO3混合溶液和KOH，都是強(qiáng)電解質(zhì)，其電導(dǎo)比較高，而電導(dǎo)檢測器是一種通用性檢測器，選擇性相對(duì)較差，對(duì)進(jìn)入電導(dǎo)池的導(dǎo)電物質(zhì)都有電導(dǎo)響應(yīng)，就是說淋洗液和待測離子都有電導(dǎo)響應(yīng)，這樣在高的淋洗液背景電導(dǎo)下待測離子的電導(dǎo)信號(hào)就相對(duì)小了。如果要提高檢測靈敏度，就需要將淋洗液轉(zhuǎn)變?yōu)榈碗妼?dǎo)的物質(zhì)，抑制器就是來完成這個(gè)任務(wù)的，將其連接在柱與電導(dǎo)池之間，在樣品經(jīng)色譜柱分離后，將淋洗液和待測離子轉(zhuǎn)變?yōu)橄鄳?yīng)的酸，比如：Na2CO3-NaHCO3轉(zhuǎn)變?yōu)樘妓?；KOH轉(zhuǎn)變?yōu)樗籆l-、SO42-轉(zhuǎn)變?yōu)辂}酸、硫酸。

這樣下來，淋洗液變成了弱酸，使得背景電導(dǎo)大幅降低。而待測離子的陽離子被轉(zhuǎn)換成了H+，H+的極限摩爾電導(dǎo)是350μS，比Na+、K+等陽離子的極限摩爾電導(dǎo)高他們分別是50μS和74μS。檢測器檢測的是陰陽離子的電導(dǎo)之和，這樣轉(zhuǎn)化成的HCl比原來樣品中的NaCl、KCl電導(dǎo)響應(yīng)提高了。從而提高了檢測靈敏度?？偨Y(jié)一下就是，經(jīng)過陰離子抑制器后背景電導(dǎo)大幅下降而待測離子的響應(yīng)電導(dǎo)上升，從而提高了檢測靈敏度。

05 離子色譜常見問題及解決辦法

01 背景抬高

① 淋洗液用超純水污染。解決辦法：更換淋洗液用超純水，去離子水電導(dǎo)率一般為18.2兆歐姆；
② 方法參數(shù)設(shè)置不當(dāng)。解決辦法：檢查實(shí)驗(yàn)方法，淋洗液選擇對(duì)應(yīng)用淋洗液，抑制器電流設(shè)定應(yīng)與所用淋洗液濃度匹配；
③ 抑制器故障。解決辦法：檢查抑制器循環(huán)水出口是否有連續(xù)的氣泡產(chǎn)生，抑制器有無漏液等情況，若無連續(xù)氣泡產(chǎn)生或由漏液情況，則應(yīng)及時(shí)更換抑制器。

02 分析泵常見故障

基線的噪聲加大，色譜峰形變差。解決辦法：通常為泵內(nèi)產(chǎn)生氣泡或漏液，嘗試手動(dòng)排氣泡操作。

03 抑制器常見故障

抑制器在離子色譜儀中具有舉足輕重的作用。抑制器工作性能的好壞對(duì)分析結(jié)果有很大的影響。抑制器最常見的故障是漏液，使峰面積減?。`敏度下降）和背景電導(dǎo)升高。

① 峰面積減小
造成峰面積減小的主要原因有：微膜脫水、抑制器漏液、溶液流路不暢和微膜被玷污。抑制器長期不用，會(huì)發(fā)生微膜脫水現(xiàn)象，為激活抑制器，可用注射器向陰離子抑制器內(nèi)以淋洗液流路相反的方向注入少許0.2mol/L的硫酸溶液。同時(shí)向再生液進(jìn)口注入少許純凈水，并將抑制器放置半小時(shí)以上。抑制器內(nèi)玷污的金屬離子可以用草酸鈉清洗。

② 漏液
抑制器漏液的主要原因是抑制器內(nèi)的微膜沒有充分水化。因此，長時(shí)間未使用的抑制器在使用前應(yīng)讓微膜水溶脹后再使用。另外要保證再生液出口順暢，因此反壓較大時(shí)也會(huì)造成抑制器漏液。另外抑制器保管不當(dāng)造成抑制器內(nèi)的微膜收縮、破裂也會(huì)發(fā)生漏液現(xiàn)象。

③ 背景電導(dǎo)值高
在化學(xué)抑制型電導(dǎo)檢測分析過程中，若背景電導(dǎo)高，說明抑制器部分存在一定的問題。大多數(shù)是操作不當(dāng)引起的。例如淋洗液或再生液流路堵塞，系統(tǒng)中無溶液流動(dòng)造成背景電導(dǎo)偏高或使用的電抑制器電流設(shè)置的太小等。膜被污染后交換容量下降亦會(huì)使背景電導(dǎo)升高。而失效的抑制器在使用時(shí)會(huì)出現(xiàn)背景電導(dǎo)持續(xù)升高的現(xiàn)象，此時(shí)應(yīng)更換一支新的抑制器。

06 案例分享

案例一 某多肽藥物中有機(jī)胺吡啶殘留的測定（陽離子模式）

在多肽藥物的合成中，常用FOMC作為氨基保護(hù)基團(tuán)，而脫去FOMC常用哌啶、DMF脫去，而哌啶作為殘留溶劑需在中間過程或終產(chǎn)品中進(jìn)行質(zhì)量控制，哌啶是純粹碳鏈供電子共軛,因此其堿性較強(qiáng)，常規(guī)的GC檢測方法峰型較差，易產(chǎn)生殘留和拖尾等問題。

陽離子模式下檢測哌啶分析方法

陽離子模式下檢測哌啶（系統(tǒng)適用性）

系統(tǒng)適用性6針重現(xiàn)性良好，保留時(shí)間RSD為0.1%，峰面積RSD為2.3%，不對(duì)稱因子1.1，連續(xù)進(jìn)樣系統(tǒng)無哌啶殘留。滿足驗(yàn)證RSD要求。

陽離子模式下檢測哌啶（線性）

0.2032μg/ml~2.0320μg/ml線性范圍良好，線性相關(guān)系數(shù)r值0.9999，加標(biāo)回收率98.9%~101.1%之間。

案例二 葡萄糖中葡糖酸含量測定，限度0.1%（陰離子模式）

葡萄糖上的醛基進(jìn)一步氧化為羧基即生成葡糖酸，其特點(diǎn)為易溶于水、幾乎無紫外吸收、極性大、沸點(diǎn)高等，常規(guī)的HPLC、GC等檢測方式無法滿足低限度的分析檢測。

陰離子模式下檢測哌啶分析方法

陰離子模式下檢測葡糖酸（系統(tǒng)適用性）

系統(tǒng)適用性6針重現(xiàn)性良好，保留時(shí)間RSD為0.3%，峰面積RSD為0.9%，不對(duì)稱因子1.0，連續(xù)進(jìn)樣系統(tǒng)無葡糖酸殘留。

陰離子模式下檢測葡糖酸（線性）

2.6062μg/ml~15.6369μg/ml線性范圍良好，線性相關(guān)系數(shù)r值0.9993，加標(biāo)回收率91.6%~95.6%之間。

案例三 某API為鹽酸鹽化合物（陰離子模式鹽酸鹽含量測定）

某IND申報(bào)藥物，API為鹽酸鹽化合物，水溶性較差，溶液顏色復(fù)雜，經(jīng)研究成鹽比會(huì)影響其晶型，氯離子含量需嚴(yán)格控制在8.7%~9.3%之間。

鹽酸鹽含量檢測（系統(tǒng)適用性）

通過離子色譜法測定氯離子含量，方法具有極其優(yōu)秀的重現(xiàn)性，可通過樣品的前處理方式處理化合物溶解性較差等問題，溶液具有顏色等問題對(duì)離子色譜法檢測無影響。

鹽酸鹽含量檢測（線性）

5.0000μg/ml~15.0000μg/ml線性范圍良好，線性相關(guān)系數(shù)r值0.9999，含量回收率99.5%~901.0%之間。

參考文獻(xiàn)：

[1]牟世芬.朱巖.劉克納.離子色譜法及其應(yīng)用.北京: 化學(xué)工業(yè)出版社，2018.3.
[2] 傅若農(nóng).色譜分析概論M.北京: 化學(xué)工業(yè)出版社，2005.3.

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