美迪西生物分析部提供全面符合FDA/OECD/CFDA GLP的生物分析服務(wù)，以支持小分子藥物、生物制劑、疫苗和PD生物標(biāo)記物的篩選與開發(fā)，及其臨床前研究和臨床研究。

美迪西分子生物學(xué)服務(wù)項(xiàng)目

質(zhì)粒制備（準(zhǔn)備）
亞克隆 
ORF克隆
基因突變
分子診斷

質(zhì)粒構(gòu)建服務(wù)流程

質(zhì)粒構(gòu)建過程

1、引物設(shè)計(jì)
2、目的片段選?。篟NA提取、RNA反轉(zhuǎn)錄、PCR擴(kuò)增、PCR產(chǎn)物純化
3、雙酶切
4、連接:1)雙酶切后，可將質(zhì)粒酶切產(chǎn)物瓊脂糖電泳1-2ul;2)酶切產(chǎn)物液相純化；3)20ul連接體系
5、轉(zhuǎn)化
6、菌落PCR
7、測序：1)搖菌；2)送樣; 3)比對 ；
8、菌種保存：菌種比對成功，則可保存菌種備用。
9、質(zhì)粒提?。壕N比對成功，凍存菌種后，菌液用于提取質(zhì)粒。

一、基本原理
分、切、連、轉(zhuǎn)、篩

1、分：分離出要克隆的目的基因及載體。

2、切：用限制性內(nèi)切酶切割目的基因和載體，使其產(chǎn)生便于連接的末端。
限制性內(nèi)切酶：是一類能識(shí)別雙鏈DNA中特定堿基順序的核酸水解酶。
限制性核酸內(nèi)切酶根據(jù)識(shí)別切割特性，催化條件及是否具有修飾酶活性分為三大類。
其中Ⅱ型酶能識(shí)別雙鏈DNA的特異順序，并在這個(gè)順序內(nèi)切割，產(chǎn)生特異性DNA片段。時(shí)DNA重組技術(shù)中常用的酶。
Ⅰ型酶：具有修飾和切割功能，無固定切割位點(diǎn)
Ⅲ型酶與Ⅰ型類似，能識(shí)別特異位點(diǎn)，但切割位點(diǎn)在識(shí)別位點(diǎn)以外
Ⅱ型酶特點(diǎn)：
①識(shí)別順序一般為4－6個(gè)堿基對
②識(shí)別順序具有180度的旋轉(zhuǎn)對稱性，呈完全的回文結(jié)構(gòu)
③Ⅱ型酶對雙鏈DNA兩條鏈同時(shí)切割，可產(chǎn)生兩種不同末端：平末端，粘末端
平末端：在識(shí)別順序的對稱軸上，對DNA同時(shí)切割形成平末端，如：SmaI  
5’－CCC GGG－3’                           5’－CCC           GGG－3’
3’－GGG CCC－5’                           3’－GGG           CCC－5’
5′突出粘末端：在識(shí)別序列的兩側(cè)末端切割DNA雙鏈，于對稱軸的5 ′末端切割產(chǎn)生5 ′端突出的粘性末端，如：Hind Ⅲ 
5’―AAGCTT―3’                          5’― A               5’－AGCTT―3’
3’―TTCGAA―5’                          3’― TTCGA－5’               A―5’
3′突出粘末端:與5′突出粘末端作用相反，產(chǎn)生3 ′端突出粘末端，如：PstI
5’―CTGCAG―3’                          5’―CTGCA－3’               G―3’
3’―GACGTC―5’                          3’―G               3’－ACGTC―5’
命名：酶來源的生物名稱縮寫
屬名-種名-株名-發(fā)現(xiàn)次序
根據(jù)其來源命名。如：EcoRI來源于大腸桿菌E.coli的RY13菌株,I指在該菌株中分離的第一個(gè)限制
酶活單位定義：在適當(dāng)?shù)臈l件下（T，pH，離子強(qiáng)度等）一小時(shí)內(nèi)完全酶解1ug特定DNA底物所需要的限制性核酸內(nèi)切酶的量，定義為1個(gè)活性單位。
目前常用的酶單位的定義是：37℃ ，1小時(shí)內(nèi)50ul反應(yīng)體系完全酶解1ugλ DNA所需的酶量。
在建立酶切體系時(shí)，酶的用量一般為1－5U/ugDNA。
   
3、連：將切割后的目的基因和載體用T4DNA連接酶連接。
①來源：T4DNA連接酶是T4噬菌體基因30編碼的產(chǎn)物。最早是從T4噬菌體感染的大腸桿菌中提取的。分子量為68KD，。
②最佳pH7.2-7.8，常用的反應(yīng)液為pH7.6的Tris－Hcl
③需要ATP作為輔助因子并由ATP提供能量
④DTT等巰基化合物可促進(jìn)連接酶的連接作用
⑤高濃度的鈉、鉀離子等抑制酶活性

4、轉(zhuǎn)：把連接好的重組載體轉(zhuǎn)化入感受態(tài)細(xì)胞的過程（細(xì)菌：E.coli，真菌：Yeast，昆蟲細(xì)胞或哺乳動(dòng)物細(xì)胞）。
5、篩：在不同層次上、不同水平上進(jìn)行篩選，鑒定所需的特異性重組子。使用各種方法，將帶有重組載體的宿主菌從培養(yǎng)基中篩選出來。例如：載體大小，酶切結(jié)果，篩選標(biāo)記等。

二、操作步驟
①酶切產(chǎn)物回收
1. 將單一目的DNA條帶切下，放入干凈的ep管中，稱取重量。
2. 向膠塊中加入3倍體積的溶膠液PN（如膠塊重量為100mg則加入300ul溶膠液PN），50℃水浴放置10min，間隔2min翻轉(zhuǎn)ep管數(shù)次，以確保膠塊充分溶解。
3. 膠塊完全溶解后，溶液降至室溫后將液體加入一個(gè)吸附柱（吸附柱放入收集管中），12000rpm離心30s，棄濾過液，將吸附柱重新放入收集管中。
4. 向吸附柱中加入700ul漂洗液PW，12000rpm離心30s，棄廢液，將吸附柱重新放入收集管中。
5. 向吸附柱中加入500ul漂洗液PW，12000rpm離心30s，棄廢液，將離心吸附柱放回收集管中，12000rpm離心2min。將吸附柱室溫放置5min徹底晾干。
6. 將吸附柱放入一個(gè)干凈的ep管中，向吸附膜中間位置懸空滴加30ul洗脫緩沖液EB，室溫放置2min，12000rpm離心1min。

②連接：連接體系一般為10-25ul，16℃連接過夜。

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