編者引言：單克隆抗體藥物進入體內(nèi)有著多個可能的存在形式：游離型、部分結(jié)合型、完全結(jié)合型?？贵w藥物體內(nèi)的多種存在形式使得其PK分析方法學設計較為復雜，如何考慮待測分子形式，如何針對性地設計出合適的Assay Format，實踐中又可能出現(xiàn)什么樣的問題和挑戰(zhàn)，在本文中作者將進行詳細闡述。下面就跟著小編一起往下看吧！

當前生物治療性產(chǎn)品中抗體藥物占主要部分，截至2017年，已經(jīng)有60多個單抗藥物獲批上市，2017年全球銷售額排名前10的藥中，有8個是大分子藥物，這8個中單抗藥就占6個，目前超500種抗體藥物處于臨床開發(fā)階段，國內(nèi)外抗體藥物開發(fā)的熱度近幾年來持續(xù)上升。這些抗體產(chǎn)品基本上都是IgG亞型的單克隆抗體。IgG是具有兩個抗原結(jié)合價的抗體亞型，這種二價性使得抗體藥物在體內(nèi)有多種可能的存在形式：二價的即游離型抗體（mAbfree），單價的即部分結(jié)合的抗體（Partial bound mAb），結(jié)合了兩個抗原的抗體即完全結(jié)合的抗體(Total bound mAb)。在進行血藥濃度檢測時，需要考慮是否有循環(huán)的、可溶性的抗體藥物靶向結(jié)合的配體分子(Ligand,L)存在，從而明確其多種可能的存在形式。如果抗體藥物靶向結(jié)合的配體是一個二聚體甚至多聚體，抗體藥物的存在形式可能更為復雜。鑒于抗體藥物體內(nèi)存在形式的多樣性，可靠的分析方法學是支持PK/PD研究，評估劑量-反應關(guān)系，評價有效性和安全性的關(guān)鍵。

利用抗體的靶向配體分子即靶點分子作為捕獲試劑，以抗Human IgGFc的抗體作為檢測試劑的配對夾心模式是一種較為方便和節(jié)約的Assay Format設計（參見圖1）。這種Assay Format可以檢測兩種形態(tài)的抗體藥物，即部分結(jié)合的抗體（Partial bound mAb）與游離抗體(mAbfree)，但不能檢測到完全結(jié)合的抗體，因此無法定量mAbtotal。若目標基質(zhì)中明確不可能存在游離靶點的干擾或mAb*L復合物，運用此種Assay Format進行PK檢測的確是一種便利的途徑，且此時檢測抗體形式也僅可能是游離抗體（mAbfree）。游離靶點的存在，和給藥后mAb*L復合的形成，靶點的蓄積會干擾此Assay Format對mAbtotal的檢測，但有研究人員提出將mAb*L酸化解離的方法使所有結(jié)合型mAb變成游離的形式，從而達到基于此Assay Format能檢測mAbtotal的目的。也有研究人員將此方法進行改造，即采用包被有Streptavidin的固相材料，并將用于捕獲的靶點分子進行Biotin標記與酸化處理的樣品同步加入反應體系中達到盡可能定量mAbtotal的目的，這樣的操作流程類似于ADA檢測的Bridge ELISA檢測模式（參見圖２）。

    圖1：靶點捕獲測游離與部分結(jié)合的抗體

    圖2：基于圖一的改造型靶點捕獲法

抗獨特型單克隆抗體是一種能夠識別、結(jié)合另一抗體可變區(qū)的抗體，在抗體藥物的藥代動力學分析上有較多的應用。在某一個特定的抗體分子中，其可變區(qū)中特異性的抗原表位部分，被稱為抗體的獨特位（idiotope）。對于某一個特定的抗體，存在著多個獨特位區(qū)域：有些獨特位和該抗體的抗原結(jié)合互補位完全重合；有些獨特位位于可變區(qū)的互補位之外；而另外一些獨特位，除了互補位之外，還包括了可變區(qū)上其它序列。一個抗體分子中所有獨特位和互補位統(tǒng)稱為該抗體的獨特型（參見圖３）,針對于某一個抗體分子獨特型部分的抗體，被稱為抗獨特型抗體（Anti-idiotype Atibody，Anti-id）。與抗原結(jié)合互補位結(jié)合的抗獨特型抗體具有抑制性或中和性，不與抗原互補位結(jié)合的抗獨特型抗體不具有抑制性和中和性。采用不同的抗獨特型抗體設計出不同的Assay Format可以針對性地檢測到各種形式的單克隆抗體藥物，即游離、部分結(jié)合或完全結(jié)合抗原的單克隆抗體。

    圖3：抗體的獨特型與獨特位

以非抑制性的抗獨特型抗體(Non-inhibitory Anti-id)作為捕獲試劑，并以非抑制性的抗獨特型抗體或抗Human IgGFc抗體（Anti-Hu Fc）作為檢測試劑可以檢測所有的抗體形式（mAbtotal）(參見圖４,圖5)。以抑制性抗體(Inhibitory Anti-id) 或靶點分子分別作為捕獲試劑、檢測試劑配對模式構(gòu)建橋式ELISA（Bridge ELISA），甚至靶點分子和抑制性抗體(Inhibitory Anti-id)配對使用可實現(xiàn)僅能檢測到游離型抗體藥物。（參見圖6）。以抑制性的抗獨特型抗體捕獲試劑，非抑制性的抗獨特型抗體(Non-inhibitory Anti-id)或抗Human IgGFc抗體（Anti-Hu Fc）作為檢測試劑可以檢測游離和部分結(jié)合的單價抗體（參見圖7）。將抑制性的抗獨特型抗體或靶點分子作為捕獲試劑，采用標記mAb藥物與樣品中非標記mAb藥物競爭結(jié)合固相抗體的方法也可以檢測游離和部分結(jié)合的單價抗體，將此種方法的捕獲試劑替換為非抑制性的抗獨特型抗體也可以檢測總的抗體藥物（mAbtotal），但競爭性的方法更較為難以獲得好的穩(wěn)健性。

    圖4：基于Non-inhibitory Anti-id和抗Hu IgGFc抗體（Anti-Hu Fc）檢測mAbtotal

    圖5：基于Non-inhibitory Anti-id作為捕獲和檢測試劑檢測mAbtotal‘’

    圖6：基于靶抗原分子配對作為捕獲和檢測試劑檢測mAbfree

    (說明:設計時將圖中的捕獲抗原和檢測抗原換成抑制型抗獨特型抗體，或其中一個抗原替代為抑制性抗獨特型抗體均可實現(xiàn)僅檢測mAbfree ，不再一一圖示)

    圖7：以抑制性和非抑制性抗獨特型抗體分別為捕獲和檢測試劑檢測mAbfree和單價抗體

對于結(jié)合型抗體藥物（部分結(jié)合和完全結(jié)合）的檢測，也可以采用與抗體藥物不具競爭性的抗靶點的抗體作為捕獲試劑，以非抑制性的抗獨特型抗體(Non-inhibitory Anti-id)或抗Human IgGFc抗體（Anti-Hu Fc）作為檢測抗體的構(gòu)成的Assay Format進行檢測（圖8）。也有文獻指出，在樣品中添加過量的游離靶向配體分子將mAb轉(zhuǎn)變成mAb*L從而盡可能實現(xiàn)此Assay Format對mAbtotal的定量。

    圖8：以非抑制性抗靶點抗體為捕獲試劑檢測完全結(jié)合和部分結(jié)合抗體

前述不同Assay Format中的檢測抗體可以根據(jù)靈敏度需要或檢測模式的需要將HRP標記替換為其它不同的分子進行標記。雖然不同的Assay Format可以針對性地實現(xiàn)PK樣品中不同抗體藥物形式的檢測，但在實踐中仍然可能面臨許多挑戰(zhàn)和問題值得思考。1）如抗獨特型抗體雖然可以較好地利用于PK生物分析中，但其制備和篩選有一定的周期和難度，更加消耗成本。2）酸化解離和將游離mAb轉(zhuǎn)化為mAb*L雖可以將對mAb部分形態(tài)檢測的Assay format應用于mAbtotal的檢測分析，但酸化后的樣品在加入中和液后解離開的靶點分子還是可能與用于捕獲的靶點分子進行競爭，因此給操作上增加了控制難度，解離后的復合物存在著又結(jié)合回去的可能，酸化是一種促進檢測方法對游離靶點的耐受性手段，但用于定量檢測的準確性還需要看方法的優(yōu)化程度；抗原抗體反應具有可逆性，是一個動態(tài)平衡的過程，而游離mAb即使在過量的靶向配體分子存在下也不可能全部轉(zhuǎn)化為mAb*L，此過程對mAbtotal定量的偏差程度需要有效控制在一定的范圍內(nèi)，有其實踐中的復雜性。3）實踐中我們首先或更容易獲得的配制PK樣品分析標準曲線的是mAbfree，游離的標準品制備的標準曲線在定量檢測結(jié)合型抗體完全合適嗎？含有與游離mAb標準品等摩爾濃度或等質(zhì)量濃度的抗體分子成分的mAb*L復合物在檢測過程中的反應能力和產(chǎn)生的信號強度一致嗎？是不是需要進行兩者的間的校正或要另外制備mAb*L復合物標準品呢？

另外，如果靶點配體分子與藥物結(jié)合外還可能與其它分子結(jié)合時，方法上如何設計和優(yōu)化；如果靶點分子是二聚體或多聚體又會對PK分析產(chǎn)生什么樣的挑戰(zhàn)；抗體藥物作為大分子藥物具有潛在的免疫原性，這又會對PK分析產(chǎn)生什么樣的影響等等沒有列入此文的討論范圍。隨著各學科的發(fā)展，新的檢測技術(shù)出現(xiàn)和實踐的深入，未來對各種形態(tài)的抗體分子檢測會更加游刃有余。

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