染色體原位分子雜交技術(shù)
染色體原位分子雜交技術(shù) 二、探針（probes） 1．基因組探針（Genomic probe）：
人類基因組內(nèi)一些高頻率的重復(fù)序列，在進(jìn)化上很少具有保守性。若 以基因組DNA作為探針，這些存在于探針和靶細(xì)胞順序中的高度重復(fù)序列之間會(huì)首先退火結(jié)合，越過(guò)那些保守的餓和單一的序列，故雜交會(huì)呈現(xiàn)出種特異性。利用這類探針在人鼠雜交細(xì)胞中可特異顯示人的遺傳物質(zhì)。
2．染色體特異性序列探針（Probe recognizing chromosome specific sequences)：
目前在人幾乎所有染色體中已經(jīng)克隆出一些重復(fù)序列，重復(fù)一百到五千次不等，各具染色體特異性。大多在某一染色體的著絲粒區(qū)或異染色質(zhì)區(qū)產(chǎn)生致密的雜交帶。從而可特異性地識(shí)別某一染色體。
3．染色體文庫(kù)探針（chromosome labraries probe）：
染色體文庫(kù)收集人類單條染色體的DNA作為探針，又稱整體染色體探針或染色體染探針。單條染色體的獲得一般有兩種方法：來(lái)自僅攜有某一條人類染色體的體細(xì)胞雜交株，或經(jīng)流式細(xì)胞分類儀從染色體懸液中分離
4．單一序列探針（single-copy sequences probe）：
FISH有一弱點(diǎn)，就是要求探針足夠大，探針越小，雜交位點(diǎn)檢出率就越低。欲利用FISH檢測(cè)存在基因組內(nèi)的單一序列基因，最有效的方法是應(yīng)用含大插入片段的克隆載體，如全Cosmids（載約40kb的插入片段），更大的YAC載體（載100-800kb插入片段）。若掌握好，小到2kb的質(zhì)粒探針亦可用FISH方法定位，但效率較低。
三、FISH技術(shù)系列 1． 24色mFISH核型分析技術(shù)
24色mFISH是近年建立的一種新技術(shù)。其原理是使用5種熒光染料按比例標(biāo)記探針，雜交后形成24條染色體各自呈現(xiàn)特異的熒光色彩以供核型分析。為研究人員提供了更豐富詳盡的細(xì)胞遺傳學(xué)信息，包括確定標(biāo)記染色體的來(lái)源、檢測(cè)微小的染色體易位和檢測(cè)復(fù)雜的染色體易位，尤其為腫瘤細(xì)胞染色體分析提供了全新、高效的方法 。
2．原位雜交顯帶技術(shù)(In situ hybridization banding,ISHB)
為了準(zhǔn)確定位原位雜交部位所處染色體及其區(qū)帶，染色體必須顯帶。但無(wú)論是先雜交后顯帶，還是顯帶后雜交，雜交與顯帶過(guò)程回互相影響效果。后來(lái)人們注意到，人類短間隔插入重復(fù)序列中的一種Alu家族，Alu片
段約300bp長(zhǎng)，在基因組中重復(fù)約九十萬(wàn)次，平均間隔3-4kb就插入一個(gè)。有人利用部分Alu序列作為引物，用PCR方法擴(kuò)增Alu之間的DNA，稱Alu-PCR法。但Alu序列在基因組內(nèi)分布不是隨機(jī)的，有些區(qū)域比較密集，有些區(qū)域較稀疏。只有前者才有PCR產(chǎn)物。人們用Alu-PCR產(chǎn)物作為探針與人類染色體標(biāo)本雜交，結(jié)果得到類似R帶的熒光帶型。故人們?cè)谶M(jìn)行基因定位時(shí)，只需將目的探針與Alu-PCR探針同時(shí)應(yīng)用，用不同顏色的熒光標(biāo)記，就可同時(shí)顯示雜交信號(hào)和染色體帶型。
3．FISH基因定位（FISH mapping）
基因定位時(shí)，不但需要確定某段靶序列在染色體上的位置，尚需確定兩個(gè)或兩個(gè)以上靶序列在線性DNA分子的排列次序和距離，才能繪出基因圖。一般用同位素雜交：先確定每一靶序列在中期染色體上的位置，然后根據(jù)它們到端粒的距離確定出線形排列次序。而用FISH方法，兩種或兩種以上的探針能同時(shí)與中期染色體雜交，只要根據(jù)兩種顏色雜交位點(diǎn)的相互位置，就能直接確定次序。但中期染色體是線形DNA分子經(jīng)過(guò)折疊和包裝后形成的，若兩個(gè)靶序列相距很近， 例如間距小于1Mbp，受包裝過(guò)程的影響，它們 在線形DNA分子上的排列與在中期染色體上的排列不一定相同，甚至可能完全相反。學(xué)者們發(fā)現(xiàn)，靶序列之間在間期核的平均相對(duì)距離與它們?cè)诰€形DNA分子上的距離呈正相關(guān)。利用間期核FISH分析不但能排除染色體包裝的影響，還能提高測(cè)距的分辨率。
四、FISH的應(yīng)用 1．基因定位與基因制圖（Gene mapping）
原理前面已敘述。FISH已經(jīng)極大地加速了人類基因定位和基因制圖的進(jìn)程。
2．基因診斷(Gene diagnosis)
精確、直觀、明了
3．間期細(xì)胞遺傳學(xué)（Interphase cytogenetics）
4．FISH在腫瘤生物學(xué)中的應(yīng)用
（1）腫瘤細(xì)胞遺傳學(xué)（Onco-cytogenetics）
（2）基因定位：FISH可用于分離出的癌基因與抑癌基因初步定位
（3）病毒基因插入基因組部分的檢測(cè)：
雖然逆轉(zhuǎn)錄病毒以激活原癌基因?yàn)橹?，也有象腺病毒、HPV、SV40等病毒以蛋白產(chǎn)物與抑癌基因蛋白產(chǎn)物相互作用而誘導(dǎo)細(xì)胞轉(zhuǎn)化。但病毒基因特別是DNA病毒多有病毒基因成分插入到人基因組。利用FISH可以檢測(cè)到病毒整合到人基因組中的情況，對(duì)深入研究病毒致癌機(jī)理，以及檢測(cè)、防治均具有重要意義。
（4）基因的擴(kuò)增與缺失
原癌基因的激活與抑癌基因的失活是目前腫瘤研究的熱點(diǎn)。
已知原癌基因的激活方式有：突變、基因擴(kuò)增、易位、病毒序列插入。
抑癌基因的激活方式有：點(diǎn)突變、基因缺失。
FISH為研究基因的擴(kuò)增和缺失提供了新的方法，能將基因擴(kuò)增和染色體重復(fù)分開(kāi)。
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