免疫組織化學(xué)染色(免疫組化)
一、原理
免疫組織化學(xué)技術(shù)是根據(jù)抗原與抗體特異性結(jié)合的原理，檢測組織中的肽和蛋白質(zhì)的一種技術(shù)?，F(xiàn)常用以下兩種檢測方法：
SP法：
一抗 + 生物素標(biāo)記二抗 + 辣根酶標(biāo)記鏈霉卵白素 + 辣根酶底物顯色
SABC法：
一抗 + 生物素標(biāo)記二抗 + SABC（鏈霉卵白素 + 辣根酶標(biāo)記生物素） + 辣根酶底物顯色
一般來說，SP法特異性較高，SABC法敏感性較高。
免疫組化最終顯色反應(yīng)是通過酶與底物作用生成不溶性色素而完成的，所選用底物與呈色反應(yīng)密切相關(guān)。最常用的是DAB,呈棕黃至棕褐色沉淀。
免疫組化
二、材料和試劑
1.試劑：酒精、二甲苯、枸櫞酸鹽、PBS、一抗、二抗試劑盒、DAB、樹膠等。
2. 儀器設(shè)備： 載玻片、染色缸、濕盒、移液器、微波爐、恒溫箱、冰箱、顯微鏡等。
三、染色程序
1.切片脫蠟至水；二甲苯Ⅰ（15分鐘）→二甲苯Ⅱ（15分鐘）→無水乙醇Ⅰ（5分鐘）無水乙醇Ⅱ（2分鐘）→90%乙醇（2分鐘）→80%乙醇（2分鐘）→70%乙醇（2分鐘）→蒸餾水（2分鐘）。
2. 3% H2O2，室溫10-20分鐘，滅活內(nèi)源性酶。(30% H2O2 1份+雙蒸水9份混合配制新鮮)
PBS洗2分鐘×2次；
3.微波修復(fù)：將切片浸入0.01M枸櫞酸鹽緩沖液PH6.0）電爐或微波爐加熱至沸騰后斷電，間隔2～3分鐘后，重復(fù)2～3分鐘，自來水浴冷至室溫，PBS洗2分鐘×2次；
4.滴加正常山羊血清封閉液，室溫20分鐘， 不洗，甩去多余液體。阻斷組織與抗體非特異性結(jié)合，降低背景染色；
5.滴加Ⅰ抗（濃縮液要適當(dāng)比例稀釋，滴加量要根據(jù)組織大小，1cmⅩ1cm大小40ul左右），37℃1-2小時或4℃過夜；PBS洗5分鐘×3次；
6.滴加生物素化二抗, 37℃或室溫30分鐘，PBS洗5分鐘×3次；
7.滴加試劑復(fù)合物，37℃或室溫30分鐘，PBS洗5分鐘×3次；
8.DAB顯色：使用DAB顯色試劑盒,室溫顯色，鏡下控制反應(yīng)時間，一般在5分鐘之內(nèi)；
9.流水沖洗；
10.蘇木精復(fù)染2分鐘；
11.流水藍(lán)化15分鐘；
12.干燥箱烤干、二甲苯透明、中性樹膠封片，置入烤箱烤片。
四、注意事項(xiàng)
1.切片要盡量薄、平、無刀痕；
2.滴加試劑前要先甩去切片PBS，再用吸水紙把組織周圍的水擦干，防止抗體流失分散，但不能干片。
免疫組化相關(guān)試劑：
振動切片封閉液(PNBS): （10ml）
終濃度： 儲液：
10%NS(二抗種屬正常動物血清) NS 1ml
2%BSA 10%BSA 2ml
5%蔗糖 20%蔗糖 2.5ml
+PBS PH7.4 to 10ml
MEMFA：（10ml）
終濃度： 儲液：
0.1M MOPS 1M MOPS 1ml
0.1mM EGTA 10mM EGTA 2ml
1mM MgSO4 1M MgSO4 10μl
3.7%PFA 10%PFA 3.7ml
+d2H2O to 10ml
AP-CDS：(100ml)
終濃度： 儲液：
100mM Tris-Cl PH9.5 1MTris-Cl PH9.5 10ml
50mM MgCl 1M MgCl 5ml
100mM NaCl 5M NaCl 2ml
0.1% Tween-20 Tween-20 100ml
5mM levamisole 1M levamisole 500ml
+d2H2O to 100ml
HRP-CDS: (1ml)
(1)6.6ml H2O2 in 100ml 0.1M TB PH 7.5
(2)20ml DAB（0.05g/ml in d2H2O）+5ml(1)液+0.1M TB PH 7.5 to 1ml
10%多聚甲醛配制方法：(100ml)
稱取10克多聚甲醛(SIGMA P6148)粉末，置于250ml錐形瓶中，加入80ml 1xPBS，再加入5-6滴（1ml吸頭）10N NaOH, 于65°C水浴中溶解3-4小時，完全溶解后冷卻至室溫，調(diào)整PH值至7.4, 溶液定容至100ml，過濾后分裝成每管4ml 或8ml, 保存于-20°C。使用前將貯液置于80°C水浴中溶解，1xPBS稀釋至4%，即可使用。(配好后4°C密閉保存，24小時內(nèi)使用。)
或直接配制4%PFA, 方法同上（可不加NaOH促溶，則不用調(diào)PH），配好后4°C密閉貯存，24小時內(nèi)使用。
0.5%明膠處理載玻片方法：
800ml處理液：
1.溶解4g 明膠和4g硫酸鉻鉀于 800ml d2H2O中，65°C加熱30min左右，使其溶解（不要使溶液沸騰）
2.過濾溶液，并將溶液在室溫下放置至50°C左右。
3.將玻片在溶液中浸提3-4次。
4.將處理的玻片在室溫下過夜使其蒸發(fā)干，為防止灰塵，用保鮮膜覆蓋。
5.130°C烤干3小時以上。
6.干燥保存。
處理液使用后，可加入0.05%NaN3，4°C保存。下次使用時將溶液加熱至50°C即可。
蛋白膠配制方法：
取新鮮雞蛋清充分?jǐn)嚢瑁?4°C過濾，清液加入等體積無熒光甘油，再加入0.05%NaN3充分混合，分裝成每管1ml，-20 °C保存。
熒光封片劑（Mowiol）配制方法：（約24ml）
將2.4g mowiol、6g甘油和6ml去離子水放入 50ml 離心管中，室溫2小時，直至mowiol完全長大變透明。加12ml0.2M Tris buffer （pH 8.5），50°C（過夜），直到mowiol完全溶解。4000-5000 rpm 離心20 minutes。分裝成每管1ml，-20°C保存。
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