一、技術(shù)簡(jiǎn)介

BiFC是由Hu等在2002年最先報(bào)道的一種直觀、快速地判斷目標(biāo)蛋白在活細(xì)胞中的定位和相互作用的新技術(shù)。

美迪西建立和完善了PROTAC生物篩選與測(cè)試平臺(tái)，美迪西生物部具有成熟的PROTAC功能檢測(cè)及驗(yàn)證技術(shù)，利用融合蛋白表達(dá)及雙熒光分子互補(bǔ)（BiFC)等技術(shù)，建立了高通量PROTAC 篩選平臺(tái)，用以篩選靶向降解致病蛋白的PROTAC小分子。

有報(bào)道在GFP的兩個(gè)β片層之間的環(huán)結(jié)構(gòu)（loop）上有許多特異位點(diǎn)可以插入外源蛋白而不影響GFP的熒光活性，BiFC技術(shù)正是利用該熒光蛋白家族的這一特性，將熒光蛋白分割成兩個(gè)不具有熒光活性的分子片段，再分別與目標(biāo)蛋白連接。如果兩個(gè)目標(biāo)蛋白因?yàn)橛邢嗷プ饔枚咏?，就使得熒光蛋白的兩個(gè)分子片段在空間上相互靠近，重新形成活性的熒光基因而發(fā)出熒光。在熒光顯微鏡下，就能直接觀察到兩目標(biāo)蛋白是否具有相互作用，并且在最接近活細(xì)胞生理狀態(tài)的條件下觀察到其相互作用發(fā)生的時(shí)間、位置、強(qiáng)弱、所形成蛋白復(fù)合物的穩(wěn)定性，以及細(xì)胞信號(hào)分子對(duì)其相互作用的影響等，這些信息對(duì)研究蛋白質(zhì)相互作用有重要意義。

其后發(fā)展出的多色熒光互補(bǔ)技(multicolor BiFC)，不僅能同時(shí)檢測(cè)到多種蛋白質(zhì)復(fù)合體的形成，還能夠?qū)Σ煌鞍踪|(zhì)間產(chǎn)生相互作用的強(qiáng)弱進(jìn)行比較.這項(xiàng)技術(shù)不需要特殊的設(shè)備，相互作用的蛋白也不需要特別的理論配比。因此，BiFC技術(shù)已被國(guó)際上眾多實(shí)驗(yàn)室采用，在活細(xì)胞內(nèi)證明蛋白質(zhì)的相互作用。本實(shí)驗(yàn)室成功應(yīng)用該技術(shù)研究轉(zhuǎn)錄因子c-Jun、ATF2和c-Fos在原代神經(jīng)元中的競(jìng)爭(zhēng)性相互作用。

BiFC技術(shù)以下幾個(gè)特點(diǎn)使其對(duì)于研究蛋白質(zhì)相互作用具有獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)：

1、能在顯微鏡下直接觀察到蛋白相互作用而且不依賴于其它次級(jí)效應(yīng)；2、該相互作用可以在活細(xì)胞中進(jìn)行觀察，排除了由于細(xì)胞裂解或固定可能帶來(lái)的假陽(yáng)性結(jié)果；3、蛋白質(zhì)在近似生理?xiàng)l件的環(huán)境下表達(dá)，表達(dá)水平及特性如翻譯后修飾極大地接近于內(nèi)源蛋白；4、不需要蛋白質(zhì)有特別的理論配比，能檢測(cè)到不同亞群蛋白質(zhì)間的相互作用；5、多色BiFC技術(shù)不僅能同時(shí)檢測(cè)到多種蛋白質(zhì)復(fù)合體的形成，還能夠?qū)Σ煌鞍踪|(zhì)間產(chǎn)生相互作用的強(qiáng)弱進(jìn)行比較；6、BiFC技術(shù)除了熒光倒置顯微鏡外，不要求特殊的設(shè)備。

實(shí)驗(yàn)簡(jiǎn)單、快捷、直觀，并適用于原核、真菌、植物、動(dòng)物等多種組織、細(xì)胞. 該技術(shù)的完善與發(fā)展必然會(huì)為蛋白質(zhì)組學(xué)、蛋白質(zhì)相互作用連鎖圖的建立帶來(lái)福音. 但是，該技術(shù)與大多檢測(cè)蛋白質(zhì)相互作用的技術(shù)一樣，也存在著假陰性和假陽(yáng)性的問(wèn)題，需要在實(shí)驗(yàn)中仔細(xì)驗(yàn)證。

二、實(shí)驗(yàn)步驟

1. 將目的基因插入到含有N片段或C片段的載體中，構(gòu)建成融合蛋白表達(dá)載體

2. 轉(zhuǎn)染細(xì)胞，熒光顯微鏡下觀察是否有相互作用。

三、應(yīng)用實(shí)例

Fig1: Potassium deprivation increases BiFC signals formed by JunVN173 and ATF2VC155. CGNs were transfected with plasmids encoding JunVN173 (JunVN) and ATF2VC155 (ATF2VC) together with ECFP. JunΔL3VN were served as a control. After 16 hr, CGNs were switched to 25K, 5K media for 1h. Photos were taken on a fluorescence microscope at a magnification of 200×. The white arrows indicated the BiFC signals (Venus fluorescence). The transfected cells were lysed for Western blotting by anti-Flag and anti-ATF2 (20F1 CST). CFP were reprobed for normalizing the tranfection efficiency. The percentage of CFP-positive cells exhibiting Venus fluorescence was scored. Data were presented as means ± S.E., n=3, Student’s t test, p<0.05.