一、蛋白質(zhì)表達(dá)與純化實(shí)驗(yàn)原理

（一）利用大腸桿菌表達(dá)進(jìn)行原核表達(dá)

基因工程的最終目的是在一個合適的系統(tǒng)中，使外源基因高效表達(dá)，從而生產(chǎn)有價值的蛋白質(zhì)產(chǎn)品。

1.原核生物基因表達(dá)的特點(diǎn)

（1）原核生物（如大腸桿菌）只有一種RNA聚合酶，識別原核的啟動子，能夠催化所有RNA合成。

（2）原核生物的基因表達(dá)是以操縱子為單位。操縱子是數(shù)個相關(guān)的結(jié)構(gòu)基因及其調(diào)控區(qū)的結(jié)合，是一個基因表達(dá)的協(xié)同單位。

（3）由于原核生物無核膜，所以轉(zhuǎn)錄與翻譯是耦聯(lián)的，二者也是連續(xù)進(jìn)行的。原核生物染色體DNA是裸露的環(huán)型DNA，轉(zhuǎn)錄成mRNA后，可直接在胞漿中與核糖體結(jié)合翻譯成蛋白質(zhì)。每個核糖體可獨(dú)立完成一條鏈的合成，多核糖體可同時在一條mRNA合成多條肽鏈，大大提高了翻譯效率。

（4）原核基因不含內(nèi)含子（intron），沒有轉(zhuǎn)錄后加工過程。

（5）原核生物基因表達(dá)的控制主要是在轉(zhuǎn)錄水平。對RNA合成的調(diào)控有兩種方式：啟始控制（啟動子控制）和終止控制（衰減子控制）。

（6）在大腸桿菌mRNA的核糖體結(jié)合位點(diǎn)上，有一個轉(zhuǎn)譯啟始密碼子及同16S核糖體RNA 3′末端堿基互補(bǔ)的序列，即SD序列，真核基因則無此序列。

2.外源基因在原核中表達(dá)的關(guān)鍵

（1）表達(dá)載體將外源基因?qū)胨拗骶笇?dǎo)宿主菌的酶系統(tǒng)合成外源蛋白；

（2）外源基因不能帶有內(nèi)含子；

（3）利用原核細(xì)胞的強(qiáng)啟動子和SD序列等控制外源基因的表達(dá)；

（4）外援基因與表達(dá)載體連接后，必須形成正確的開放閱讀框架；

（5）利用宿主菌的調(diào)控系統(tǒng)，調(diào)節(jié)外源基因的表達(dá)，防止表達(dá)的外源基因產(chǎn)物對宿主菌的毒害。

3.外源基因在原核細(xì)胞中表達(dá)的重要調(diào)控元件

（1）啟動子

-35區(qū)：位于轉(zhuǎn)錄啟始位點(diǎn)上游35bp處，一般由10bp組成，與RNA聚合酶δ亞基結(jié)合；

-10區(qū)（TATA box）：位于轉(zhuǎn)錄啟始位點(diǎn)上游5-10bp處，一般由6-8bp，富含A T，與RNA聚合酶的核心酶結(jié)合。

原核表達(dá)載體所用的啟動子必須是原核啟動子，通常所用的可調(diào)控的強(qiáng)啟動子有：lac（乳糖啟動子）、trp（色氨酸啟動子），λPL（λ噬菌體左向啟動子），Tac（乳糖和色氨酸的雜和啟動子）等。

（2）SD順序

mRNA在細(xì)菌中轉(zhuǎn)譯率嚴(yán)格依賴于SD序列以及SD序列與啟始密碼子AUG之間的距離，例如，當(dāng)lac啟動子的SD序列距AUG為7個核苷酸時，IL-2表達(dá)最高，為2581單位，而間隔8個核苷酸時，表達(dá)水平降到不足5個單位。另外某些蛋白質(zhì)與SD序列結(jié)合也回影響蛋白質(zhì)的翻譯。

（3）終止子（terminator）

4.原核表達(dá)載體的類型

（1）非融合型

不與細(xì)菌的任何蛋白或多肽融合在一起的表達(dá)蛋白。

優(yōu)點(diǎn)：非常接近于生物體內(nèi)天然蛋白質(zhì)；

缺點(diǎn)：容易被細(xì)菌蛋白酶破壞，未知蛋白難于純化。

（2）融合型

蛋白質(zhì)的一端由原核DNA序列或其它序列編碼，另一端由真核DNA的完整序列編碼。

優(yōu)點(diǎn)：應(yīng)該避免細(xì)菌蛋白酶的破壞，由于融合部分的關(guān)系，常易于表達(dá)產(chǎn)物的分離純化。

缺點(diǎn)：由于細(xì)菌的一段蛋白或多肽的存在，有時會影響其結(jié)構(gòu)，需去掉。

5.用于原核細(xì)胞表達(dá)的外源基因

由于原核細(xì)胞缺乏真核細(xì)胞轉(zhuǎn)錄后的加工系統(tǒng)，mRNA的內(nèi)含子不能切除，成熟的mRNA不能形成，同時原核細(xì)胞也缺乏真核細(xì)胞翻譯后的加工系統(tǒng)。只能用cDNA而不能用基因組DNA，或體外合成基因，PCR擴(kuò)增基因等。

（二）利用HIC樹脂純化ZsGreen蛋白

甲基化疏水反應(yīng)層析（HIC）樹脂是利用疏水基團(tuán)進(jìn)行分離蛋白的一種簡單而有效的方法。結(jié)合緩沖液中的Cl-排斥帶負(fù)電荷的ZsGreen分子的β-外殼，這種排斥使分子內(nèi)部外翻，露出疏水基團(tuán)。露出的疏水基團(tuán)牢牢與HIC樹脂的非極性甲基基團(tuán)結(jié)合；中性鹽洗脫使ZsGreen保持為疏水狀態(tài)；但是可以洗脫未結(jié)合或者是結(jié)合弱的蛋白；低鹽緩沖液使疏水基團(tuán)回到ZsGreen分子的原來位置，從而使ZsGreen分子HIC樹脂中釋放。

（三）SDS-PAGE分析

聚丙烯酰胺凝膠電泳是網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，具有分子篩效應(yīng)，它有兩種形式，一種是非變性聚丙烯酰胺凝膠，蛋白質(zhì)在電泳中保持完整的狀態(tài)，蛋白在其中依三種因素分開：蛋白大小，形狀和電荷。而SDS-PAGE僅根據(jù)蛋白分子量亞基的不同而分離蛋白。這個技術(shù)首先是1967年由shapiro建立，他們發(fā)現(xiàn)在樣品介質(zhì)和丙烯酰胺凝膠中加入離子去污劑和強(qiáng)還原劑后，蛋白質(zhì)亞基的電泳遷移率主要取決于亞基分子量的大小，電荷因素可以忽視。

SDS是陰離子去污劑，作為變性劑和助溶試劑，它能斷裂分子內(nèi)和分子間的氫鍵，使分子去折疊，破壞蛋白分子的二、三級結(jié)構(gòu)。而強(qiáng)還原劑如巰基乙醇，二硫蘇糖醇能使絆胱氨酸殘基間的二硫鍵斷裂。在樣品和凝膠中加入還原劑和SDS后，分子被解聚成多肽鏈，解聚后的氨基酸側(cè)鏈和SDS結(jié)合成蛋白——SDS膠束，所帶的負(fù)電荷大大超過了蛋白原有的蛋白量，這樣就消除了不同分子間的電荷差異和結(jié)構(gòu)差異。SDS-PAGE一般采用的是不連續(xù)緩沖系統(tǒng)，于連續(xù)緩沖系統(tǒng)相比，能夠有較高的分辨率。

濃縮膠的作用是有堆積作用，凝膠濃度較小，孔徑較大，把較稀的樣品加在濃縮膠上，經(jīng)過大孔徑凝膠的遷移作用而被濃縮至一個狹窄的區(qū)帶。當(dāng)樣品液和濃縮膠選Tris-HCl緩沖液，電極液選Tris-甘氨酸。電泳開始后，HCl解離成Cl-，甘氨酸解離出少量的甘氨酸根離子。蛋白質(zhì)帶負(fù)電荷，因此一起向正極移動，其中Cl-最快，甘氨酸根離子最慢，蛋白居中。電泳開始時Cl-泳動率最大，超過蛋白，因此在后面形成低電導(dǎo)區(qū)，而電場強(qiáng)度與低電導(dǎo)區(qū)成反比，因而產(chǎn)生較高的電場強(qiáng)度，使蛋白和甘氨酸根離子迅速移動，形成以穩(wěn)定的界面，使蛋白聚集在移動界面附近，濃縮成一中間層。

本實(shí)驗(yàn)中，我們首先提取大腸桿菌（E.coli）基因組，PCR擴(kuò)增冷激蛋白CspA的啟動子、上游調(diào)控及下游5′-UTR區(qū)序列，得到cspA1、cspA2和cspA3，在兩端引入酶切位點(diǎn)；用限制性內(nèi)切酶切割質(zhì)粒pZsGreen1-1，得到綠色熒光蛋白ZsGreen報(bào)告基因；以pET-28a（+）為骨架，酶切、連接，構(gòu)建含冷激啟動子、報(bào)告基因?yàn)閆sGreen的表達(dá)載體pCspA1-ZsGreen、pCspA2-ZsGreen、pCspA3-ZsGreen（圖1）及對照常溫表達(dá)載體pT7-ZsGreen（圖5-1）。

二、實(shí)驗(yàn)儀器及藥品 （1）STE的配制（表3-1）

表3-1STE（100mL）配方

在60mL dH2O中加入5mol/L NaCl 2mL、1mol/L Tris-HCl（pH8.0） 1mL和0.5mol/L EDTA（pH8.0）200μL，混勻，加dH2O定容至100mL，1.034×105Pa高壓蒸汽滅菌15min，備用。配制好的STE含有0.1mol/L NaCl，10mmol/L Tris-HCl和1mmol/L EDTA。

（2）溶液I的配制（表3-2）

表3-2溶液I（100mL）配方

60mL dH2O中加入0.9g葡萄糖、1mol/L Tris-HCl（pH8.0） 2.5mL和0.5mol/L EDTA（pH8.0）  2mL，混勻，加dH2O定容至100mL，1.034×105Pa高壓蒸汽滅菌15min，4℃貯存。配制好的溶液I含有50mmol/L葡萄糖，25mmol/L Tris-HCl和10mmol/L EDTA。

（3）溶液II的配制（表3-3）

溶液II中含有0.4mol/L NaOH和1% SDS，該試劑需要新鮮配制，配制后將NaOH和SDS按1：1的比例混合。

表3-3溶液II（1mL）配方

（4）溶液III的配制（表3-4）

表3-4溶液III的配制（100mL）

配制好的溶液III含3mol/L KAc、5mol/L冰醋酸（pH4.8）。

三、質(zhì)粒抽提實(shí)驗(yàn)方法

質(zhì)粒提取過程如下：

（1）將瓊脂培養(yǎng)板上的陽性單菌落，移至3mL LB液體培養(yǎng)基中（含Amp或Kana），或?qū)⒋竽c桿菌的甘油菌按1：30的比例接到LB液體培養(yǎng)基中，37℃劇烈搖蕩培養(yǎng)過夜；

（2）取500μL菌體，與40%甘油等體積混合，-70℃保存，剩余的菌體用于質(zhì)粒的提??；

（3）取出1.5-2mL菌液移至Eppendorf管中，12000rpm，4℃離心30s，棄上清，用1mL    STE懸浮菌體沉淀，洗滌菌體，再離心回收菌體；

（4）再重復(fù)用STE漂洗菌體，離心后，去盡上清液；

（5）將細(xì)菌沉淀懸浮于100μL冰預(yù)冷的溶液I中，強(qiáng)烈振蕩混勻；

（6）加入200μL新配制的溶液II，輕輕顛倒離心管5次以混合內(nèi)容物，不要強(qiáng)烈振蕩，放置冰上3min左右（根據(jù)不同菌株，可適當(dāng)縮短）；

（7）加入150μL冰預(yù)冷的溶液III，輕輕顛倒5次，混勻，置于冰上5min；

（8）15000rpm，4℃離心5min，將上清轉(zhuǎn)移到另一個離心管中；

（9）向上清中加入等體積的酚：氯仿（1：1），混勻，15000rpm離心5min，將上清轉(zhuǎn)移到另一個離心管中；

（10）加入2倍體積冰預(yù)冷的無水乙醇，室溫放置2min，沉淀雙鏈DNA；

（11）15000rpm，4℃離心5min；

（12）倒掉上清，使液體盡量流盡，空氣中干燥沉淀；

（13）用20μL含有RNaseA的TE緩沖液溶解核酸沉淀，瞬時離心，混勻，貯存于-20℃冰箱中備用。

四、實(shí)驗(yàn)結(jié)果

（一）未純化SDS-PAGE分析

將含有pCspA1-ZsGreen、pCspA2-ZsGreen、pCspA3-ZsGreen的大腸桿菌（E.coli），在16℃表達(dá)；含有pT7-ZsGreen的大腸桿菌（E.coli）在37℃下表達(dá)至OD600＝0.6時，加入IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，不加IPTG誘導(dǎo)的作為對照。誘導(dǎo)表達(dá)5h后收集菌體，進(jìn)行SDS-PAGE分析（圖5-2）。

圖5-2中，M為低分子量蛋白Maker。1-5分別為pT7-ZsGreen（IPTG-，37℃）、pT7-ZsGreen（IPTG+，37℃）、pCspA1-ZsGreen（16℃）、pCspA2-ZsGreen（16℃）、pCspA3-ZsGreen（16℃）表達(dá)ZsGreen。箭頭所示為ZsGreen，其大小約為27KD。SDS-PAGE結(jié)果顯示：三種低溫誘導(dǎo)表達(dá)載體pCspA1-ZsGreen、pCspA2-ZsGreen、pCspA3-ZsGreen在16℃下表達(dá)ZsGreen正常，可用作下一步對其翻譯效率的分析。

（二）純化后SDS-PAGE分析

將含有低溫誘導(dǎo)表達(dá)載體pCspA1-ZsGreen、pCspA2-ZsGreen、pCspA3-ZsGreen的大腸桿菌（E.coli），在16℃下表達(dá)，以1h為時間間隔收集菌體，利用HIC樹脂純化ZsGreen蛋白，進(jìn)行SDS-PAGE分析（圖5-3）。

圖5-3中，M為低分子量蛋白Maker。A1-7、B8-14、C15-21分別為pCspA1-ZsGreen、pCspA2-ZsGreen、pCspA3-ZsGreen 16℃表達(dá)4h HIC純化后SDS-PAGE。箭頭所示為ZsGreen，其大小約為27KD