bDNA技術(shù)在寡核苷酸及mRNA藥物生物分析中的應(yīng)用與實(shí)例分享
隨著技術(shù)的不斷進(jìn)步，生物醫(yī)藥蓬勃發(fā)展，藥物形式多變多樣，已經(jīng)從傳統(tǒng)的化藥、抗體、蛋白、多肽延伸到細(xì)胞、核酸等多種形式。新藥物形態(tài)的不斷涌現(xiàn)，也對(duì)相關(guān)的生物分析技術(shù)提出了高要求和新挑戰(zhàn)，新型分析技術(shù)也不斷被隨之引入。美迪西新媒體的生物分析系列專(zhuān)欄，繼續(xù)邀請(qǐng)本領(lǐng)域的資深專(zhuān)業(yè)人員從不同的視角筆談生物分析，本期將分享核酸類(lèi)藥物的別樣分析技術(shù)：bDNA。
近年來(lái)，核酸藥物迎來(lái)了其快速發(fā)展的階段。2016年至今，共有 15 款核酸藥物成功在美國(guó)和/或歐盟獲批上市，包括 13 款寡核苷酸藥物和2 款 mRNA 疫苗，其中寡核苷酸藥物中 8 款為反義核酸藥物（ASO），5 款為小干擾核酸藥物（siRNA）。可見(jiàn)，以ASO和siRNA為代表的寡核苷酸和mRNA成為了核酸類(lèi)藥物研發(fā)的熱門(mén)細(xì)分領(lǐng)域，國(guó)內(nèi)外已有越來(lái)越多的寡核苷酸和mRNA進(jìn)入到了IND或臨床研究階段。
核酸類(lèi)藥物除了涉及合成修飾、遞送、穩(wěn)定性及免疫原性等常見(jiàn)的要考慮和克服的問(wèn)題外，在進(jìn)入IND和臨床階段也避免不了藥代動(dòng)力學(xué)研究方面的挑戰(zhàn)，藥代動(dòng)力學(xué)的生物分析方法就是其要面對(duì)的一個(gè)很現(xiàn)實(shí)的技術(shù)性挑戰(zhàn)。對(duì)于mRNA來(lái)說(shuō)，極易被核酸酶降解，不穩(wěn)定，半衰期短，方法需要高度靈敏。雖然RT-qPCR靈敏度很高且可以執(zhí)行其定量分析，但涉及復(fù)雜的核酸提取和反轉(zhuǎn)錄，且核酸提取過(guò)程中會(huì)有損失、絕對(duì)提取回收率不可控等問(wèn)題；對(duì)于寡核苷酸雖然可以通過(guò)修飾等技術(shù)手段而使不穩(wěn)定、半衰期短等情況得以有所改善，但其本身分子量不大不小的特性（一般ASO為18-30nt的單鏈形式，siRNA為20-25nt的雙鏈形式），無(wú)論是傳統(tǒng)的小分子分析技術(shù)質(zhì)譜還是傳統(tǒng)的核酸分析技術(shù)qPCR對(duì)其分析都具有挑戰(zhàn)性，如質(zhì)譜技術(shù)涉及到殘留保留、儀器污染及靈敏度問(wèn)題；Stem-loop RT-qPCR的方法雖然可以勉強(qiáng)用于寡核苷酸，但qPCR技術(shù)本身其實(shí)更加適合于較長(zhǎng)的核酸分子，若是修飾的核酸分子則潛在更不適用。除了質(zhì)譜和qPCR技術(shù)外，液相熒光檢測(cè)技術(shù)及Hybrid-ELISA（hELISA）技術(shù)等都在核酸類(lèi)藥物分析上有所應(yīng)用。這幾大類(lèi)技術(shù)形成的方法各有優(yōu)勢(shì)，但也各有其劣勢(shì)，有的需消耗較高的樣本量，有的靈敏度仍難以足夠高，有的涉及復(fù)雜的反應(yīng)步驟或特殊酶的使用等等局限性。當(dāng)前還有一種核酸分析技術(shù)即bDNA(branch DNA)技術(shù)，可以在不同程度上彌補(bǔ)上述各技術(shù)的一些不足。1. bDNA技術(shù)及其優(yōu)勢(shì)
bDNA技術(shù)即支鏈DNA技術(shù)，該技術(shù)綜合了分子標(biāo)記、探針設(shè)計(jì)、分子雜交、熒光或化學(xué)發(fā)光檢測(cè)于一體的分析技術(shù)。該項(xiàng)技術(shù)的本質(zhì)是核酸分子雜交技術(shù)的升級(jí)版，同樣需要特異性捕獲探針和檢測(cè)探針。
不過(guò)此技術(shù)中的捕獲探針和檢測(cè)探針都帶有額外的延伸序列，捕獲探針可以利用其延伸序列與Assay Plate上預(yù)包被的通用捕獲序列互補(bǔ)結(jié)合；檢測(cè)探針為雙“Z”型特殊結(jié)構(gòu)，其下端與目標(biāo)分子特異性互補(bǔ)， “Z”型探針上端的延伸部分可以與預(yù)放大探針結(jié)合，然后由預(yù)放大探針、放大探針、標(biāo)記探針逐步結(jié)合構(gòu)成樹(shù)枝狀結(jié)構(gòu)的探針組實(shí)現(xiàn)檢測(cè)信號(hào)的級(jí)聯(lián)放大，從而達(dá)到提高靈敏度的效果【圖1】。對(duì)于較短的小核酸，檢測(cè)探針的雙“Z”型結(jié)構(gòu)可以用非“Z”型的延伸探針靈活替代，只要延伸序列可以與預(yù)放大探針互補(bǔ)結(jié)合即可。由于預(yù)放大探針、放大探針、標(biāo)記探針都是固定的通用序列，分析所用的微孔板可預(yù)包被通用捕獲探針，因此這些試劑和耗材可以以試劑盒的形式被商業(yè)化提供。目前Thermo旗下的QuantiGene就圍繞bDNA技術(shù)提供了較為全面的配套固定組成的試劑盒產(chǎn)品，其中已經(jīng)包含了固定組成的信號(hào)放大系統(tǒng)和預(yù)包被通用捕獲探針的Assay Plate及一些常用試劑，大大便利了科研人員使用這項(xiàng)技術(shù)。因此，實(shí)踐中只要針對(duì)具體的目標(biāo)分子設(shè)計(jì)、篩選和定制好特異性的捕獲探針與檢測(cè)探針就可以嘗試?yán)胋DNA技術(shù)為自己的目標(biāo)分析物開(kāi)發(fā)和優(yōu)化方法。
該技術(shù)克服了傳統(tǒng)的Real Time PCR技術(shù)中的缺陷與不確定因素，無(wú)需抽提純化RNA，無(wú)需反轉(zhuǎn)錄，無(wú)需PCR擴(kuò)增，只要將樣本用特定裂解液裂解后，經(jīng)探針雜交與信號(hào)放大后即可迅速得到核酸定量結(jié)果，每個(gè)反應(yīng)微孔的終末狀態(tài)樣本用量才僅20-40微升即可。bDNA技術(shù)在化妝品研發(fā)、生物醫(yī)藥及病毒檢測(cè)等領(lǐng)域中均有應(yīng)用，此技術(shù)在國(guó)外醫(yī)藥研發(fā)領(lǐng)域應(yīng)用較為廣泛，但目前國(guó)內(nèi)醫(yī)藥研發(fā)領(lǐng)域?qū)嶋H應(yīng)用甚少。由于其高靈敏度且消耗樣本量少的特點(diǎn)，在臨床前藥代動(dòng)力學(xué)和組織分布研究中，尤其是對(duì)于那些特殊給藥、特殊取材，采樣量有限的小動(dòng)物試驗(yàn)有著獨(dú)特的應(yīng)用優(yōu)勢(shì)。該項(xiàng)技術(shù)可以廣泛應(yīng)用于ASO，siRNA等各種寡核苷酸以及mRNA的檢測(cè)。Moderna公司就曾用此項(xiàng)技術(shù)進(jìn)行其mRNA產(chǎn)品的生物分布研究。美迪西生物技術(shù)藥物分析部不僅將該技術(shù)成功應(yīng)用于mRNA產(chǎn)品的分析，而且也成功將其應(yīng)用到了ASO和siRNA兩大最熱門(mén)的寡核苷酸藥物分析中，在國(guó)內(nèi)率先實(shí)現(xiàn)了此技術(shù)在核酸藥物上的全面應(yīng)用。此文將各結(jié)合具體實(shí)際案例對(duì)此技術(shù)的應(yīng)用進(jìn)行簡(jiǎn)要介紹。2. bDNA技術(shù)在mRNA分析中的應(yīng)用
mRNA是一條單鏈核酸分子，其長(zhǎng)度和堿基數(shù)相對(duì)于ASO和siRNA要大很多。因此在利用bDNA實(shí)現(xiàn)mRNA分析時(shí)，其有著寡核苷酸不可與其比擬的優(yōu)勢(shì)，因?yàn)閙RNA長(zhǎng)度足夠，因此可以對(duì)一個(gè)mRNA設(shè)計(jì)多對(duì)雙“Z”探針，Z型探針越多則信號(hào)放大倍數(shù)更高，靈敏度就更易提高。
對(duì)一個(gè)mRNA分子，與ASO和siRNA在該技術(shù)利用上所考慮的不同點(diǎn)是，除了基于mRNA序列設(shè)計(jì)特異的捕獲探針和雙“Z”型探針外，還需要設(shè)計(jì)一些與mRNA互補(bǔ)的封閉探針以防非特異性信號(hào)的產(chǎn)生【圖2】。
圖2 bDNA技術(shù)在mRNA分析中的原理示意圖
我們基于bDNA技術(shù)可以很好地應(yīng)用于mRNA分析的原理，對(duì)某mRNA分子利用bDNA技術(shù)開(kāi)發(fā)了其組織分布的分析方法。如下例所示，我們可以利用bDNA技術(shù)不僅將組織中mRNA的檢測(cè)下限做到小于100copies/uL，而且其準(zhǔn)確度和精密度都可以完全滿(mǎn)足LBA技術(shù)的法規(guī)所要求接受標(biāo)準(zhǔn)。從標(biāo)準(zhǔn)曲線上可以看出，bDNA技術(shù)方法中不同濃度標(biāo)準(zhǔn)品的儀器響應(yīng)信號(hào)的倍增與濃度倍增間的關(guān)系趨近了理想的正比例關(guān)系【表1】，因此可以做到利用一次方程線性擬合【圖3】，因其脫離了抗原-抗體反應(yīng)關(guān)系的利用，故其信號(hào)與濃度間的線性關(guān)系不同于LBA技術(shù)及hybrid-ELISA技術(shù)，而后兩者往往要用4參數(shù)或5參數(shù)的曲線進(jìn)行擬合。表 1 bDNA檢測(cè)某mRNA的標(biāo)準(zhǔn)曲線數(shù)據(jù)
圖3 bDNA檢測(cè)某mRNA標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合
在一項(xiàng)Preclinical study中，第一輪樣品分析中的僅極少部分的組織樣品因需進(jìn)行了重分析，而重復(fù)分析的結(jié)果幾乎全部與初次分析結(jié)果一致，即90%以上的樣品與初次分析結(jié)果一致【圖4】，顯示bDNA技術(shù)方法具有良好的重現(xiàn)性。
圖4 某bDNA方法分析結(jié)果的重現(xiàn)性
3. bDNA在反義寡核苷酸（ASO）分析上的應(yīng)用
bDNA應(yīng)用于ASO和siRNA時(shí)與在mRNA上的應(yīng)用有所不同，因?yàn)榍皟烧呤枪押塑账?，鏈很短而不必要封閉探針，且因?yàn)殒湺潭膊环奖闶褂秒p“Z”型探針，也更不可能使用多個(gè)雙“Z”型探針進(jìn)行信號(hào)的放大，一般情況下只能用非“Z”型的序列延長(zhǎng)探針，例如【圖5】所示。因此對(duì)于ASO的分析，其難度也相對(duì)大于mRNA。
美迪西實(shí)驗(yàn)室也將bDNA實(shí)際運(yùn)用到了血漿中ASO的分析，也獲得令人滿(mǎn)意的靈敏度參見(jiàn)【表2】和【圖6】。雖然其bDNA Assay開(kāi)發(fā)和反應(yīng)條件探索的過(guò)程要比mRNA艱辛復(fù)雜。而且基于本實(shí)驗(yàn)室經(jīng)驗(yàn)，對(duì)于不同的ASO，其反應(yīng)步驟和反應(yīng)體系需要靈活變更，雖然目前可以買(mǎi)到含通用探針、Buffer和底物的試劑盒，但不能被其完全局限。
為了適應(yīng)具體研究的ASO的特性尤其是為避免穩(wěn)定性和基質(zhì)干擾的影響，我們需要針對(duì)性摸索和替換一些特殊緩沖液或裂解液成分，這些是通用試劑無(wú)法提供的。在靈敏度的實(shí)現(xiàn)與提高上，我們也基本上認(rèn)為對(duì)于同樣的一個(gè)小核酸分子，bDNA技術(shù)較于Hybrid-immnoassays 相對(duì)更容易促進(jìn)Assay的靈敏度。表 2 bDNA檢測(cè)某ASO-X的標(biāo)準(zhǔn)曲線數(shù)據(jù)
圖6 bDNA檢測(cè)某ASO的標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合
4. bDNA在小干擾RNA（siRNA）分析上的應(yīng)用
基于bDNA技術(shù)進(jìn)行siRNA的分析，本質(zhì)上也是針對(duì)其中的一條鏈構(gòu)建特異性探針和進(jìn)行信號(hào)放大，反應(yīng)原理圖類(lèi)似于ASO，因此本文不再單獨(dú)用圖展示，仍可參見(jiàn)【圖5】。然而，bDNA在用于構(gòu)建ASO和siRNA分析方法時(shí)也有著很大的區(qū)別，ASO是單鏈，而siRNA是雙鏈結(jié)構(gòu)，因此在bDNA技術(shù)應(yīng)用于ASO要相對(duì)于siRNA容易實(shí)現(xiàn)；siRNA在利用bDNA技術(shù)平臺(tái)構(gòu)建分析方法時(shí)挑戰(zhàn)相對(duì)較大，因?yàn)閟iRNA自身雙鏈特征，對(duì)于siRNA樣品需要多一個(gè)變性的步驟，而變性后又要防止在退火雜交時(shí)互補(bǔ)鏈自身的復(fù)性結(jié)合而影響了捕獲探針和檢測(cè)探針與目標(biāo)鏈的結(jié)合，這是不同于單鏈RNA的最大擔(dān)憂(yōu)。
探針序列的選擇和退火孵育溫度的探索非常重要，另外同樣也避免不了穩(wěn)定性和不同基質(zhì)的影響，siRNA各反應(yīng)條件在方法開(kāi)發(fā)中的摸索更加復(fù)雜，這些都是此技術(shù)應(yīng)用于siRNA分析實(shí)踐中的需要個(gè)性化克服的重要的挑戰(zhàn)。一旦這些基本問(wèn)題得到克服，也可以開(kāi)發(fā)出很高靈敏度的siRNA分析方法，下面圖表即為美迪西實(shí)驗(yàn)室基于bDNA技術(shù)分析血漿中某siRNA的案例展示，如【表3】所示可以做到個(gè)位數(shù)的pg級(jí)靈敏度，無(wú)論是ULOQ（80pg/mL）還是LLOQ（1.25pg/mL）各濃度的不同套質(zhì)控樣品都能達(dá)到傳統(tǒng)PK分析方法的回收率接受范圍【圖7】，此靈敏度下的儀器響應(yīng)值相對(duì)不高但仍能執(zhí)行很好的一次方程線性擬合【圖8】。表 3 bDNA檢測(cè)某siRNA-X的標(biāo)準(zhǔn)曲線數(shù)據(jù)
圖8 bDNA檢測(cè)某siRNA的標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合
對(duì)于小寡核苷酸，bDNA除了應(yīng)用于ASO及siRNA以外，還可以用于miRNA和核酸適配體等各種小核酸分子，應(yīng)用原理與形式總體與前兩者雷同，且miRNA及核酸適配體（一個(gè)上市后退市）目前未見(jiàn)正式成藥，也就不在此文贅述。
綜上所述，bDNA技術(shù)是一種可以很好的可廣泛應(yīng)用于各類(lèi)核酸檢測(cè)的技術(shù)，無(wú)論是長(zhǎng)的mRNA，還是短的小寡核苷酸，相較于LC-MS/MS或HRMS及Hybrid-immunoassays等系列技術(shù)，其相對(duì)更容易提升靈敏度。目前基因治療領(lǐng)域已經(jīng)有越來(lái)越多的核酸藥物使用特殊的局部給藥方式，常涉及到特殊的取材如腦脊液，小動(dòng)物尿液、甚至還有一些是活檢組織樣品。因此，對(duì)相關(guān)生物分析也提出了高靈敏度低樣品消耗的更高的現(xiàn)實(shí)需求，也是相關(guān)醫(yī)藥研發(fā)工作者的現(xiàn)實(shí)需求，bDNA恰是滿(mǎn)足此類(lèi)需求一種很好的技術(shù)。對(duì)于mRNA的分析，傳統(tǒng)的RT-qPCR方式雖然可以分析且也有很高的靈敏度，但因核酸的提取步驟繁雜不可能避免抽提過(guò)程中核酸的絕對(duì)損失，而且不同的提取試劑、人員或提取儀器都會(huì)有差異，這些都潛在令qPCR方法的實(shí)際靈敏度有所折扣。bDNA技術(shù)避免了這些前處理過(guò)程的影響，而且可以做到用單位體積目標(biāo)分析物拷貝數(shù)作為其絕對(duì)定量單位，且bDNA技術(shù)方法一旦開(kāi)發(fā)出來(lái)要比qPCR的方法穩(wěn)健得多，可以用傳統(tǒng)的藥代生物分析的行業(yè)技術(shù)接收標(biāo)準(zhǔn)來(lái)對(duì)此類(lèi)方法進(jìn)行約束質(zhì)控。這是其與qPCR技術(shù)有顯著區(qū)別的地方。基于美迪西生物分析實(shí)驗(yàn)室的全面應(yīng)用和體驗(yàn)，bDNA技術(shù)無(wú)疑是有顯著優(yōu)勢(shì)和應(yīng)用價(jià)值的適于醫(yī)藥研發(fā)工業(yè)領(lǐng)域的核酸檢測(cè)技術(shù)。bDNA雖然是一項(xiàng)比較優(yōu)越的技術(shù)，但是實(shí)際應(yīng)用于各類(lèi)核酸分子分析中并非是可以一蹴而就的，同樣需要較復(fù)雜的方法開(kāi)發(fā)和優(yōu)化過(guò)程。同Hybrid-immunoassays一樣，這類(lèi)技術(shù)方法高度依賴(lài)特異性探針的設(shè)計(jì)去成就其方法的特異性，在各類(lèi)探針齊全的條件下仍然要花費(fèi)較長(zhǎng)的時(shí)間和精力摸索反應(yīng)條件及各類(lèi)反應(yīng)緩沖液的配方甚至調(diào)整不同探針的反應(yīng)模式、反應(yīng)體系和反應(yīng)順序等系列條件才能開(kāi)發(fā)建立出一套滿(mǎn)意適用的分析方法。正如前文指出，bDNA在被利用于各類(lèi)型核酸分析中，對(duì)于mRNA、單鏈寡核苷酸（ASO）和雙鏈寡核苷酸（siRNA）其應(yīng)用難度是遞進(jìn)的，而且每一個(gè)類(lèi)型核酸中具體藥物分子的bDNA方法也都是個(gè)性化的，難度因分子本身而異，需要針對(duì)具體分子的序列和特點(diǎn)進(jìn)行分析方法的開(kāi)發(fā)。在生物分析方法開(kāi)發(fā)上，bDNA技術(shù)并沒(méi)有比其它類(lèi)型方法顯著節(jié)省時(shí)間和精力，而且bDNA技術(shù)因其探針結(jié)構(gòu)特殊性，該方法的應(yīng)用成本要高于其它核酸分析技術(shù)。然而，一旦基于bDNA技術(shù)原理的方法開(kāi)發(fā)成功，則具有非?？煽康姆€(wěn)健性和重現(xiàn)性。bDNA技術(shù)還可以執(zhí)行多重檢測(cè)，其所涉及到的雙“Z”型探針或其它延伸探針及信號(hào)放大系統(tǒng)不僅可以直接用于核酸的檢測(cè)，還可以拓展到其它的分析檢測(cè)平臺(tái)上。Thermo公司就將這類(lèi)探針技術(shù)運(yùn)用到流式平臺(tái)針對(duì)細(xì)胞層面的轉(zhuǎn)錄本檢測(cè)中，固定并破膜的細(xì)胞可直接與特異的延伸標(biāo)記探針?lè)跤谛盘?hào)放大系統(tǒng)進(jìn)行信號(hào)放大，最后被流式檢測(cè)，此技術(shù)被命名為PrimeFlow RNA分析技術(shù)。除了在流式平臺(tái)的拓展應(yīng)用外，雙“Z”型探針及信號(hào)放大系統(tǒng)還可以被組織細(xì)胞的目標(biāo)RNA原位雜交RNAscope技術(shù)所應(yīng)用，從而使RNA原位雜交具有高度特異性、提高單分子檢測(cè)的敏感性并帶來(lái)極高的信噪比，能夠在單細(xì)胞水平同步定量多個(gè)RNA的表達(dá)，在獲得單細(xì)胞中單拷貝RNA表達(dá)數(shù)據(jù)的同時(shí)提供完整的組織形態(tài)學(xué)信息，這也是小核酸研發(fā)領(lǐng)域基于組織學(xué)水平考察藥物分布所需要的技術(shù)。盡管目前在國(guó)內(nèi)醫(yī)藥研發(fā)領(lǐng)域bDNA技術(shù)的應(yīng)用相對(duì)較少，但隨著基因治療藥物尤其是其分支領(lǐng)域核酸類(lèi)藥物的蓬勃發(fā)展， bDNA將會(huì)逐步走入廣大研發(fā)人員視野，該技術(shù)的性能將被越來(lái)越多的人認(rèn)知和認(rèn)可。
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