急性毒性試驗/重復(fù)給藥篩選試驗

急性毒性評價是體內(nèi)安全性評價的基本類型之一，藥品注冊往往需要進行急性毒性評價。急性毒性試驗的數(shù)據(jù)在安全性評價中有著特殊的作用，可以在最初的毒性描述中確定MTD或MFD。在這些試驗中得到的數(shù)據(jù)可以為安全藥理學(xué)試驗以及重復(fù)給藥毒性試驗的劑量選擇提供依據(jù)。急性毒性試驗還可用于早期候選藥物的篩選，或者與簡單的重復(fù)給藥毒性試驗同時運用。應(yīng)注意的是，只有獲得了基于暴露途徑和臨床適應(yīng)癥的生物利用度和系統(tǒng)暴露的資料，才能為急性毒性研究提供有價值的信息。

（一）急性毒性（重復(fù)給藥篩選試驗）
急性毒性試驗可以有多種形式，但其主要目的是相同的，即測試所篩選的藥物在臨床劑量的若干倍數(shù)下能被耐受。篩選試驗的好處在于可以在同一試驗中同時比較幾個候選藥物。耐受性指標(biāo)[如體重和（或）飼料消耗的變化以及異常的臨床癥狀]可以為確定哪種候選藥物提供更好的參考依據(jù)。此時動物品種的選擇一般不要求是全部動物品種，但至少評價一種嚙齒類動物。對于預(yù)定期每天服用的藥物，在5~7天的暴露周期內(nèi)對重復(fù)給藥進行評價也是合理的。這有助于初步評價臨床病理學(xué)終點的潛在改變，并且對于其他毒性試驗項目的劑量選擇也是有用的，但它不能替代急性毒性試驗進行注冊申請?zhí)峤弧?br />

（二）急性毒性試驗的基本設(shè)計包括每組動物數(shù)量相對較少的數(shù)個劑量組。對于嚙齒類動物試驗，每個劑量組每個性別5只動物是足夠的。第二種動物品種一般使用2~3只動物。應(yīng)設(shè)溶媒對照組至少3個供試品劑量組。劑量組也可以再增加，尤其是在進行急性毒性試驗時對其毒理學(xué)概況知之甚少的情況下。在單次給予供試品后，體重、飼料消耗量和臨床觀察室獲悉毒理學(xué)作用的關(guān)鍵性數(shù)據(jù)。在給藥指定的天數(shù)后對存活動物給予安樂死（通常是給藥后第14天）。大體解剖旨在對組織和器官的肉眼可見病變進行評估。但在大多數(shù)情況下對這些組織不再做進一步的組織病理學(xué)檢查。毒性評價一般僅限于觀察明顯的毒性反應(yīng)，如體重變化、飼料消耗量減少和（或）死亡、病態(tài)和供試品的藥理學(xué)左右等臨床觀察。急性毒性試驗資料可為隨后的重復(fù)給藥毒性試驗的劑量設(shè)計提供參考。

服務(wù)項目：

考察受試藥物對小鼠的 LD50 或最大耐受量（Maximal tolerance dose, MTD）。
半數(shù)致死量（Median lethal dose, LD50）：在一定試驗條件下引起 50%受試動物死亡的劑量。該值是經(jīng)統(tǒng)計學(xué)處理所得的結(jié)果。
最大耐受量（Maximal tolerance dose, MTD）：不引起受試動物死亡的最高劑量。

服務(wù)內(nèi)容：

1、 小鼠急性毒性預(yù)試驗，確定合理劑量設(shè)計
2、 可根據(jù)受試藥物特點選擇合適的給藥途徑，包括灌胃、靜脈注射、腹腔注射、皮下注射等
3、 對部分可疑動物進行病理組織學(xué)檢查

客戶提供：受試樣品;

我們提交：詳細(xì)實驗報告;

服務(wù)周期：根據(jù)實驗方案確定，請咨詢;

服務(wù)收費：根據(jù)實驗方案確定，請咨詢;

服務(wù)特點：1.通過預(yù)實驗確定給藥劑量及組間劑量比；2.不同給藥途徑滿足不同受試藥物測定需要。

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一、概述

動物急性毒性試驗（Acute toxicity test，Single dose toxicity test），研究動物一次或24小時內(nèi)多次給予受試物后，一定時間內(nèi)所產(chǎn)生的毒性反應(yīng)。擬用于人體的藥物通常需要進行動物急性毒性試驗。急性毒性試驗處在藥物毒理研究的早期階段，對闡明藥物的毒性作用和了解其毒性靶器官具有重要意義。急性毒性試驗所獲得的信息對長期毒性試驗劑量的設(shè)計和某些藥物Ⅰ期臨床試驗起始劑量的選擇具有重要參考價值，并能提供一些與人類藥物過量急性中毒相關(guān)的信息。
急性毒性試驗的設(shè)計，應(yīng)該在對受試物認(rèn)知的基礎(chǔ)上，遵循“具體問題具體分析”的原則。應(yīng)根據(jù)化合物的結(jié)構(gòu)特點、理化性質(zhì)、適應(yīng)癥特點和試驗?zāi)康牡冗x擇合理的試驗方法，設(shè)計適宜的試驗方案，并結(jié)合其它藥理毒理研究信息對試驗結(jié)果進行全面的評價。
急性毒性試驗應(yīng)符合一般動物試驗的基本原則，即隨機、對照和重復(fù)。

二、基本概念

最大無毒性反應(yīng)劑量：即未見毒性反應(yīng)劑量（No observed adverse effect level,NOAEL），指受試物在一定時間內(nèi)，按一定方式與機體接觸，用靈敏的現(xiàn)代檢測方法和觀察指標(biāo)未發(fā)現(xiàn)損害作用的最高劑量。
最小毒性反應(yīng)劑量：動物出現(xiàn)毒性反應(yīng)的最小劑量。
最大耐受量（Maximal tolerance dose, MTD）：不引起受試動物死亡的最高劑量。
最小致死劑量（Minimal lethal dose, MLD）：引起個別受試動物出現(xiàn)死亡的劑量。
半數(shù)致死量（Median lethal dose, LD50）：在一定試驗條件下引起50%受試動物死亡的劑量。該值是經(jīng)統(tǒng)計學(xué)處理所得的結(jié)果。

三、研究內(nèi)容

（一）受試物
急性毒性試驗的受試物應(yīng)采用制備工藝穩(wěn)定、符合臨床試驗用質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定的樣品，并注明受試物的名稱、來源、批號、含量（或規(guī)格）、保存條件及配制方法等，并附有研制單位的自檢報告。所用輔料、溶媒等應(yīng)標(biāo)明批號、規(guī)格和生產(chǎn)廠家，并符合試驗要求。
（二）動物
1.種屬：不同種屬的動物各有其特點，對同一藥物的反應(yīng)會有所不同。嚙齒類動物和非嚙齒類動物急性毒性試驗所得的結(jié)果，無論是質(zhì)還是量上均會存在差別。從充分暴露受試物毒性的角度考慮，應(yīng)從嚙齒類動物和非嚙齒類動物中獲得較為充分的安全性信息。因此，急性毒性試驗應(yīng)采用至少兩種哺乳動物。一般應(yīng)選用一種嚙齒類動物加一種非嚙齒類動物進行急性毒性試驗。若未采用非嚙齒類動物進行急性毒性試驗，應(yīng)闡明其合理性。
2. 性別：通常采用兩種性別的動物進行試驗，雌雄各半。若采用單性別動物進行試驗，則應(yīng)闡明其合理性。
3. 年齡：通常采用健康成年動物進行試驗。如果受試物擬用于兒童或可能用于兒童，建議必要時采用幼年動物進行試驗。
4. 動物數(shù)：對于所用的動物數(shù)，應(yīng)根據(jù)動物的種屬和研究目的來確定。動物數(shù)應(yīng)符合試驗方法及其結(jié)果分析評價的需要。應(yīng)在獲得盡量多信息的前提下，使用盡量少的動物數(shù)。
5. 體重：動物初始體重不應(yīng)超過或低于平均體重的20%。
可根據(jù)試驗?zāi)康募笆茉囄锏奶攸c，確定實驗動物的性別和年齡等。動物應(yīng)符合國家有關(guān)規(guī)定的等級要求，來源、品系、遺傳背景清楚，并具有實驗動物質(zhì)量合格證。
（三）給藥途徑
給藥途徑不同，受試物的吸收速度、吸收率和暴露量會有所不同，因此需要采用不同給藥途徑進行急性毒性試驗。另外，通過對不同途徑給藥所得結(jié)果進行比較，可以獲得一些初步的生物利用度信息。通常，給藥途徑應(yīng)至少包括臨床擬用途徑和一種能使原形藥物較完全進入循環(huán)的途徑（如靜脈注射）。如果臨床擬用途徑為靜脈給藥，則僅此一種途徑即可。經(jīng)口給藥前動物一般應(yīng)進行一段時間（通常一夜）的禁食，不禁水。因為胃內(nèi)容物會影響受試物的給藥容量，而嚙齒類動物禁食時間的長短會影響到藥物代謝酶的活性和受試物腸道內(nèi)吸收，從而影響毒性的暴露。
（四）給藥劑量水平
急性毒性試驗的重點在于觀察動物出現(xiàn)的毒性反應(yīng)?？蛇x擇適當(dāng)?shù)姆椒ㄟM行急性毒性研究，對于非嚙齒類動物給予出現(xiàn)明顯毒性的劑量即可，給藥劑量沒有必要達(dá)到致死水平。
總體上，給藥劑量應(yīng)從未見毒性劑量到出現(xiàn)嚴(yán)重毒性 (危及生命的) 劑量，同時設(shè)空白和/或溶媒（輔料）對照組。
不同動物和給藥途徑下的最大給藥容量可參考相關(guān)文獻及實際情況來確定。
（五）觀察時間及指標(biāo)
給藥后，一般連續(xù)觀察至少14天，觀察的間隔和頻率應(yīng)適當(dāng)，以便能觀察到毒性反應(yīng)出現(xiàn)的時間及其恢復(fù)時間、動物死亡時間等。觀察的指標(biāo)包括一般指標(biāo)（如動物外觀、行為、對刺激的反應(yīng)、分泌物、排泄物等）、動物死亡情況（死亡時間、瀕死前反應(yīng)等）、動物體重變化（給藥前、試驗結(jié)束處死動物前各稱重一次，觀察期間可多次稱重）等。記錄所有的死亡情況、出現(xiàn)的癥狀，以及癥狀起始的時間、嚴(yán)重程度、持續(xù)時間等。
（六）病理學(xué)檢查
所有的試驗動物均應(yīng)進行大體解剖，包括試驗過程中因瀕死而處死的動物、死亡的動物以及試驗結(jié)束時仍存活的動物。任何組織器官出現(xiàn)體積、顏色、質(zhì)地等改變時，均應(yīng)記錄并進行組織病理學(xué)檢查。

四、數(shù)據(jù)分析及評價

（一）結(jié)果處理和分析
1.根據(jù)所觀察到的各種反應(yīng)出現(xiàn)的時間、嚴(yán)重程度、持續(xù)時間等，分析各種反應(yīng)在不同劑量時的發(fā)生率、嚴(yán)重程度。根據(jù)觀察結(jié)果歸納分析，判斷每種反應(yīng)的劑量－反應(yīng)及時間－反應(yīng)關(guān)系。
2. 判斷出現(xiàn)的各種反應(yīng)可能涉及的組織、器官或系統(tǒng)等。
3.根據(jù)大體解剖中肉眼可見的病變和組織病理學(xué)檢查的結(jié)果，初步判斷可能的毒性靶器官。組織病理學(xué)檢查應(yīng)附有病理學(xué)檢查負(fù)責(zé)人簽名和藥品注冊申請人蓋章的報告及有病變組織的病理照片。
4.根據(jù)不同劑量組各種毒性反應(yīng)及發(fā)生率、動物死亡情況等，確定動物對受試物的無毒性反應(yīng)劑量和嚴(yán)重毒性反應(yīng)劑量。為此，建議采用適當(dāng)?shù)脑囼灧椒▉頊y定最大無毒性反應(yīng)劑量或最小毒性反應(yīng)劑量，最大耐受劑量或近似致死量或最小致死劑量等，以初步判斷受試物的安全范圍。
5. 對于需要測定LD50的藥物，應(yīng)采用合理的統(tǒng)計學(xué)方法對其進行求算。
6. 說明所使用的計算方法和統(tǒng)計學(xué)方法，提供所選用方法合理性的依據(jù)。
（二）綜合評價
根據(jù)各種反應(yīng)在不同劑量下出現(xiàn)的時間、發(fā)生率、劑量-反應(yīng)關(guān)系、不同種屬動物及實驗室的歷史背景數(shù)據(jù)、病理學(xué)檢查的結(jié)果以及同類藥物的特點，判斷所出現(xiàn)的反應(yīng)與藥物作用的相關(guān)性?？偨Y(jié)受試物的安全范圍、出現(xiàn)毒性的嚴(yán)重程度及可恢復(fù)性；根據(jù)毒性可能涉及的部位，綜合大體解剖和組織病理學(xué)檢查的結(jié)果，初步判斷毒性作用靶器官。
急性毒性試驗的結(jié)果可作為后續(xù)毒理研究劑量選擇的參考，也可提示一些后續(xù)毒性研究需要重點觀察的指標(biāo)。此外，根據(jù)不同途徑給藥時動物的反應(yīng)情況，初步判斷受試物的生物利用度，為劑型開發(fā)提供參考。

五、急性毒性試驗常用試驗方法

由于受試物的化學(xué)結(jié)構(gòu)、活性成分的含量各異，毒性反應(yīng)的強弱也不同，研究者應(yīng)根據(jù)受試物的特點，選擇以下方法或國內(nèi)外公認(rèn)的試驗方法。
1. 近似致死劑量法
該方法主要用于非嚙齒類的動物試驗。試驗方法如下：
一般采用6 只健康的Beagle 犬或猴。犬的年齡一般為4-6 月齡，猴的年齡一般為2-3 歲，選用其他動物時應(yīng)說明理由。
根據(jù)小動物的毒性試驗結(jié)果、受試物的化學(xué)結(jié)構(gòu)和其它有關(guān)資料，估計可能引起毒性和死亡的劑量范圍。按50%遞增法，設(shè)計出含數(shù)個劑量的劑量序列表。
根據(jù)估計，由劑量序列表中找出可能的致死劑量范圍，在此范圍內(nèi)，每間隔一個劑量給一只動物，測出最低致死劑量和最高非致死劑量，然后用二者之間的劑量給一只動物。如果該劑量下動物未發(fā)生死亡，則該劑量與最低致死劑量之間的范圍為近似致死劑量范圍；如果該劑量下動物死亡，則該劑量與最高非致死劑量間的范圍為近似致死劑量范圍。

2. 最大給藥量法
對于某些低毒的受試物可采用該方法。在合理的最大給藥濃度及給藥容量的前提下，以允許的最大劑量單次給藥或24 小時內(nèi)多次給藥(劑量一般不超過5g/kg 體重)，觀察動物出現(xiàn)的反應(yīng)。一般使用10-20 只動物，連續(xù)觀察14天。

3. 固定劑量法（Fixed-dose procedure）
該方法最初于1984 年由英國毒理學(xué)會提出，不以死亡作為觀察終點，而是以明顯的毒性體征作為終點進行評價。
試驗選擇5、50、500和2000mg/kg四個固定劑量進行試驗，特殊情況下可增加5000mg/kg劑量。實驗動物首選大鼠，給藥前禁食6-12小時，給受試物后再禁食3-4小時。采用一次給藥的方式進行。如無資料證明雄性動物對受藥試物更敏感，首先用雌性動物進行預(yù)試。根據(jù)受試物的有關(guān)資料，從上述四個劑量中選擇一個作為初始劑量；若無有關(guān)資料可作參考時，可用500mg/kg作為初始劑量進行預(yù)試，如無毒性反應(yīng)，則用2000mg/kg進行預(yù)試，此劑量如無死亡發(fā)生即可結(jié)束預(yù)試。如初始劑量出現(xiàn)嚴(yán)重的毒性反應(yīng)，即降低一個檔次的劑量進行預(yù)試，如此時動物存活，就在此兩個固定劑量之間選擇一個中間劑量試驗。每個劑量給一只動物，預(yù)試一般不超過5只動物。每個劑量試驗之間至少應(yīng)間隔24小時。給受試物后的觀察期至少7天，如動物的毒性反應(yīng)到第7天仍然存在，尚應(yīng)繼續(xù)觀察7天。
在上述預(yù)試的基礎(chǔ)上進行正式試驗。每個劑量至少用10只動物，雌雄各半。根據(jù)預(yù)試的結(jié)果，在上述四種劑量中選擇一個可能產(chǎn)生明顯毒性但又不引起死亡的劑量進行試驗，如預(yù)試結(jié)果表明，5.0mg/kg 引起死亡，則降低一個劑量檔次進行試驗。
給受試物后至少應(yīng)觀察2周，根據(jù)毒性反應(yīng)的具體特點可適當(dāng)延長。對每只動物均應(yīng)仔細(xì)觀察并詳細(xì)記錄各種毒性反應(yīng)出現(xiàn)和消失的時間。給受試物當(dāng)天至少應(yīng)觀察記錄兩次，以后可每天一次。觀察記錄的內(nèi)容包括皮膚、粘膜、毛色、眼睛、呼吸、循環(huán)、自主活動及中樞神經(jīng)系統(tǒng)行為表現(xiàn)等。動物死亡時間的記錄要準(zhǔn)確。給予受試物前、后各1周、動物死亡及試驗結(jié)束時應(yīng)稱取動物的體重。所有動物包括死亡或處死的動物均應(yīng)進行尸檢，尸檢異常的器官應(yīng)作組織病理學(xué)檢查。固定劑量試驗法所獲得的結(jié)果，參考下表標(biāo)準(zhǔn)進行評價。

4. 上下法（階梯法，序貫法，Up and down method）
該方法由Dixon和Mood首次提出，1985年Bruce又進行了改進，目前是OECD和EPA推薦的方法之一。其最大的特點是節(jié)省實驗動物，同時，不但可以進行毒性表現(xiàn)的觀察，還可以估算LD50及其可信限，適合于能引起動物快速死亡的藥物。該方法分為限度試驗和主試驗。限度試驗主要用于有資料提示受試物毒性可能較小的情況?？梢詮呐c受試物相關(guān)的化合物或相似的混合物或產(chǎn)品中獲得相關(guān)毒性資料。在相關(guān)毒性資料很少或沒有時，或預(yù)期受試物有毒性時，應(yīng)進行主試驗。
限度試驗：是最多用5 只動物進行的序列試驗。試驗劑量為2000 mg/kg，特殊情況下也可使用5000 mg/kg。
2000 mg/kg劑量水平的限度試驗: 將受試物給予1 只動物。如果該動物死亡，則進行主試驗；如果該動物存活，依次將受試物給予另外4只動物，動物總數(shù)為5只。如果1 只動物在試驗后期死亡，而其他動物存活，應(yīng)停止對其他動物給藥，對所有動物進行觀察，是否在相似的觀察期間也發(fā)生死亡。后期死亡的動物應(yīng)與其他死亡的動物同樣計數(shù)，對結(jié)果進行如下評價: 有3 只或3 只以上動物死亡時，LD50小于2000mg/kg；有3只或3只以上動物存活時，LD50大于2000 mg/kg；如果有3 只動物死亡，則進行主試驗。
5000mg/kg劑量水平的限度試驗:特殊情況下，可考慮使用5000mg/kg的劑量。將受試物給予1只動物。如果該動物死亡，則進行主試驗；如果該動物存活，將受試物給予另外2只動物。如果這2只動物都存活，則LD50大于5000mg/kg，停止試驗（即不再對其他動物給藥，觀察14天）。如果這2只動物中有1只死亡或者2只均死亡，將受試物給予另外2只動物，一次1只。如果1只動物在試驗后期死亡，而其他動物存活，應(yīng)停止對其他動物給藥，對所有動物進行觀察，是否在相似的觀察期間也發(fā)生死亡。后期死亡的動物應(yīng)與其他死亡的動物同樣計數(shù)，對結(jié)果進行如下評價。有3只或3 只以上動物死亡時，LD50小于5000 mg/kg；有3 只或3 只以上動物存活時，LD50大于5000 mg/kg。
主試驗:由一個設(shè)定的給藥程序組成，在此程序中，每次給藥1只動物，間隔至少48小時。給藥間隔取決于毒性出現(xiàn)時間、持續(xù)時間和毒性的嚴(yán)重程度。在確信前一只動物給藥后能存活之前，應(yīng)推遲按下一劑量給藥。時間間隔可以適當(dāng)調(diào)整，但使用單一時間間隔時，試驗會更簡便。
第一只動物的給藥劑量低于LD50的最接近的估計值。如果該動物存活，第二只動物給予高一級劑量；如果第一只動物死亡或出現(xiàn)瀕死狀態(tài)，第二只動物給予低一級劑量。劑量級數(shù)因子應(yīng)選定為1/（劑量-反應(yīng)曲線斜率估計值）的反對數(shù)（對應(yīng)于斜率2的級數(shù)因子為3.2），并應(yīng)在整個試驗過程中保持不變。當(dāng)沒有受試物的斜率的有關(guān)資料時，使用3.2為劑量級數(shù)因子。使用默認(rèn)級數(shù)因子時，劑量應(yīng)從以下序列中選擇：1.75、5.5、17.5、55、175、550、2000mg/kg（或有特殊要求時1.75、5.5、17.5、55、175、550、1750、5000mg/kg）。如果沒有受試物的致死估計值，應(yīng)該從175mg/kg開始。如果預(yù)期動物對該受試物的耐受程度變化很大（即，估計斜率小于2.0），那么開始試驗前應(yīng)考慮增加劑量級數(shù)因子超過按對數(shù)劑量計算的默認(rèn)值0.5（即，級數(shù)因子為3.2）。同樣，對于已知斜率很陡的受試物，應(yīng)選擇小于默認(rèn)值的級數(shù)因子。
在決定是否及如何對下一只動物給藥之前，每只動物都應(yīng)認(rèn)真觀察達(dá)48小時。當(dāng)滿足停止試驗標(biāo)準(zhǔn)之一時，停止給藥，同時根據(jù)終止時所有動物的狀態(tài)計算LD50估計值和可信區(qū)間。 用最大可能性法計算LD50值 (美國EPA開發(fā)了相應(yīng)的計算軟件，AOT425StatPgm)。
當(dāng)滿足下列停止試驗標(biāo)準(zhǔn)之一時，停止試驗：
（a） 連續(xù)3 只動物存活；
（b） 任意連續(xù)6 只試驗動物中有5 只連續(xù)發(fā)生存活/死亡轉(zhuǎn)換；
（c） 第一只動物發(fā)生轉(zhuǎn)換之后至少有4 只動物進入試驗，并且其LD50估算值的范圍超出臨界值（2.5 倍）。（首次轉(zhuǎn)換的第4 只動物之后，對每次給藥進行計算）。
對于LD50和斜率的各種組合，在動物發(fā)生死亡/存活轉(zhuǎn)換之后，用4~6只動物即可滿足停止試驗標(biāo)準(zhǔn)（C）。但在一些情況下，化合物的劑量-反應(yīng)曲線的斜率較小，可能另外還需要增加動物（總共可達(dá)15 只）。

5. 累積劑量設(shè)計法（金字塔法，Pyramiding dosage design）
在非嚙齒類動物進行急性毒性試驗可采用此方法。經(jīng)典的試驗設(shè)計需要8 只動物，分對照組和給藥組，每組4只動物，雌雄各2只。
劑量的設(shè)計可以是1、3、10、30、100、300、1000、3000mg/kg，也可以采用10、20、40、80、160、320、640、1280mg/kg，通常隔日給予下一個高劑量，劑量逐漸加大，直到出現(xiàn)動物死亡時或達(dá)到劑量上限時為止。
當(dāng)沒有動物死亡時，MLD（最小致死劑量）和LD50大于最高劑量或受限制劑量。當(dāng)在某一劑量所有動物均出現(xiàn)死亡時，MLD和LD50應(yīng)在最后兩個劑量之間。當(dāng)在某一劑量部分動物出現(xiàn)死亡，部分死亡出現(xiàn)在后繼的下一個高劑量，此時，MLD位于首次出現(xiàn)死亡的劑量和前一低劑量之間，LD50則應(yīng)在首次出現(xiàn)動物死亡的劑量和所有動物均死亡的劑量之間。假如沒有動物死亡發(fā)生，常常以最高劑量給予動物5-7 天，以確定后續(xù)的重復(fù)給藥試驗中高劑量的選擇。

6. 半數(shù)致死量法
是一種經(jīng)典的急性毒性試驗方法，試驗結(jié)果經(jīng)統(tǒng)計學(xué)處理可獲得受試物的LD50。