在絕大數(shù)藥物靶點中酶學(xué)靶點是一個大類。本文主要以酶催化的基本化學(xué)反應(yīng)原理為起點，概述和闡述下酶催化反應(yīng)的幾個基本概念Km，Kcat和Ki，以及其測定方法，分析下一個靈敏的酶學(xué)篩選方法開發(fā)的幾個關(guān)鍵步驟，概括論述下酶抑制劑的類型以及在實驗檢測過程中不同類型酶抑制劑的IC50和Ki之間的關(guān)聯(lián)。

酶是生命體內(nèi)化學(xué)反應(yīng)的催化劑，能夠在生理溫度和常壓下加快化學(xué)反應(yīng)的速度，幾乎所有的細(xì)胞活動進(jìn)程都需要酶的參與以提高效率。特定酶活性或者表達(dá)量的增強(qiáng)或者缺少都有可能導(dǎo)致生命活動的異常，疾病的發(fā)生。在藥物研發(fā)過程中酶是十分重要的靶點，也是十分有潛力和效果的靶點，如最近在中國上市的吉利德的慢性丙型肝炎新藥索華迪（索磷布韋），其效果和價格一樣讓人印象深刻，一個療程6萬人民幣左右，對于基因1，2，3，6型HCV具有抗病毒活性，治愈率高達(dá)92%-100%，其作用的靶點是NS5B RNA聚合酶；又如晚期大腸癌的一線用藥是伊立替康，其代謝活性成分SN-38是DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅰ抑制劑，其與拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅰ及DNA形成的復(fù)合物能引起DNA單鏈斷裂，阻止DNA復(fù)制及抑制RNA合成，為細(xì)胞周期S期特異性。首款獲得FDA批準(zhǔn)的雙藥HIV療法新藥Juluca，其兩個活性成分，Dolutegravir是HIV-1整合酶鏈轉(zhuǎn)移抑制劑（integrase strand transfer inhibitor，INSTI）；Rilpivirine是一款非核苷逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑（non-nucleoside reverse transcriptase inhibitor，NNRTI）。酶作為一個很有潛力的靶點，如何建立一個簡單高通量的酶學(xué)抑制物的篩選方法是這篇文章筆者主要討論的問題。我們可以重溫一下酶學(xué)基本的反應(yīng)原理開始酶催化反應(yīng)原理

絕大多數(shù)酶學(xué)反應(yīng)都可以用下圖簡單的模型進(jìn)行描述：

E代表酶，S代表底物，P代表催化產(chǎn)物。ES代表在催化反應(yīng)開始前形成的中間態(tài)產(chǎn)物酶-底物復(fù)合物，E和S形成ES復(fù)合物的反應(yīng)是可逆反應(yīng)的過程，k1是E和S形成ES復(fù)合物的結(jié)合速率常數(shù)，相當(dāng)于配體受體結(jié)合時的Kon或者Ka, k-1是ES解離形成E和S的解離速率常數(shù)，相當(dāng)于配體受體結(jié)合時的Koff或者Kd（關(guān)于以上概念可參考筆者前期的文章--生物功能學(xué)篩選評價技術(shù)之親和力評價篇）；ES解離形成E和P的過程在反應(yīng)初期一般認(rèn)為是不可逆的過程，反應(yīng)產(chǎn)物E會被反應(yīng)體系中的過量的S捕捉，k2是ES形成E和P的速率常數(shù)，也被稱之為Kcat,相當(dāng)于配體受體結(jié)合時的Kon或者Ka酶催化效率：

一個酶相對于其底物的催化效率主要由兩個方面決定Kcat/Km， Km值（米氏常數(shù)）越小， Kcat值越大，催化效率越高。Km值的化學(xué)本質(zhì)是E和S可逆反應(yīng)過程中的解離平衡常數(shù)KD,反映的是E和S親和力的強(qiáng)弱，Km值越小親和力越強(qiáng)，效率越高。Kcat值是ES解離形成E和P的速率常數(shù)。Km值和Kcat值測定

米氏方程描述了在穩(wěn)態(tài)反應(yīng)條件下酶催化反應(yīng)中初始反應(yīng)速度V和底物濃度 [S]的相關(guān)關(guān)系：

當(dāng)V等于1/2的 Vmax時，底物濃度 [S]為Km值。

在實際的檢測過程主要包括以下幾個步驟：
1. 少量固定濃度的酶（nM或者pM級別），梯度濃度稀釋的底物（底物濃度相對于酶濃度由遠(yuǎn)遠(yuǎn)過量，mM到μM）進(jìn)行分組，酶催化反應(yīng)；
2. 每個分組對酶催化反應(yīng)的產(chǎn)物進(jìn)行動力學(xué)檢測（酶標(biāo)儀進(jìn)行熒光，吸光度檢測或者HPLC檢測），選取各分組信號時間的線性反應(yīng)區(qū)域進(jìn)行V計算；

3. 選取梯度濃度稀釋的底物動力學(xué)檢測的線性區(qū)域的斜率作為初始反應(yīng)速度V進(jìn)行數(shù)據(jù)米氏方程擬合，擬合圖形的平臺期為Vmax, 1/2的Vmax時V對應(yīng)的底物濃度值是Km值。處理結(jié)果示意圖如下：

4. 當(dāng)酶催化反應(yīng)達(dá)到最大速度時，S遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于E，所以所有的E均被S捕獲，E和S的逆反應(yīng)速度可忽略不計，[ES]=[E]

Vmax=[ES]*Kcat=[E] *Kcat,所以Kcat= Vmax/[E]

以上是Km和Kcat的測定和計算過程，值得注意的是在實際的實驗過程中需要注意以下幾點：

    1.必須是動力學(xué)讀數(shù)，選取初始反映的線性段的斜率作為初始反應(yīng)的速度。終點法讀數(shù)的結(jié)果很多時候并不可靠，應(yīng)為酶催化反應(yīng)隨著時間的進(jìn)行底物的消耗，反應(yīng)速度會從勻速到非均速變化，如果采用終點法可能得到不真實的初始速度，如下圖：

2. 必須確認(rèn)儀器的檢測線性，當(dāng)酶催化反應(yīng)，產(chǎn)物的量過多時，超過儀器檢測的線性區(qū)域時，檢測的產(chǎn)物的量不準(zhǔn)，影響到后續(xù)參數(shù)的計算，如下圖：

酶學(xué)藥物篩選模型的建立

酶學(xué)篩選方法的幾個核心參數(shù)包括酶，反應(yīng)環(huán)境，底物和抑制物。一般來講反應(yīng)環(huán)境需要查閱文獻(xiàn)進(jìn)行調(diào)研，確定PH值，離子強(qiáng)度，洗滌劑等對酶活的影響，底物可以根據(jù)酶催化原理選擇天然底物，也可以選擇合成底物（底物的選擇和后續(xù)配套的檢測方法緊密相關(guān)）。一個酶學(xué)方法的開發(fā)可能涉及到以下一些因素：

    底物的選擇和配套的檢測方式，如下圖某蛋白水解酶，其識別的位點是氨基酸線性表位，可以人工合成多肽，在其N端和C端分別加入熒光基團(tuán)和淬滅基團(tuán)，正常狀態(tài)下或者酶活抑制狀態(tài)，該多肽在酶標(biāo)儀340nm激發(fā)時，其發(fā)射光會被淬滅基團(tuán)吸收，在405nm無信號產(chǎn)生；酶催化反應(yīng)會將該多肽剪切，當(dāng)酶標(biāo)儀340nm激發(fā)時，405nm有信號產(chǎn)生。 

    又如某病毒逆轉(zhuǎn)錄酶，合成RNA模板和對應(yīng)引物，在其引物上進(jìn)行生物素標(biāo)記，其中堿基上進(jìn)行Ru標(biāo)記，隨著酶催化的逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)的進(jìn)行，引物上不斷有Ru標(biāo)記堿基上去形成核苷酸序列，通過親和素的板子捕捉引物，檢測Ru信號值來評判酶的催化和抑制的活性。

酶，底物濃度的選擇和反應(yīng)時間的選擇

    當(dāng)酶對應(yīng)的底物確定以后，選取少量的酶濃度（pM或者nM）對底物進(jìn)行Km測定，選取底物的Km濃度作為篩選的反應(yīng)濃度，選取該濃度下線性的反應(yīng)時間內(nèi)的某個時間點作為反應(yīng)終止或者檢測的時間。酶和梯度稀釋的化合物進(jìn)行預(yù)孵育后，加入Km濃度的底物，反應(yīng)一段時間后進(jìn)行檢測，這個就是一般酶學(xué)篩選模型。 

酶抑制劑機(jī)理研究

對于靶點酶的抑制劑，主要可以歸納為三類（competitive競爭性, noncompetitive非競爭性, uncompetitive不競爭性）

    competitive競爭性抑制劑只和自由的酶結(jié)合，通常情況下和底物共同競爭結(jié)合位點（活性中心），當(dāng)然也有競爭性抑制劑和底物互斥的情況出現(xiàn)，兩個中只有一個能夠和自由的酶結(jié)合。在競爭性抑制劑存在的情況下，酶相對于底物的Km和Vmax測定時，測得得表觀Km值增加，Vmax值不變，如下圖所示，幾種競爭性抑制劑的圖示： 

noncompetitive非競爭性抑制劑

    非競爭性抑制劑可以和自由的酶結(jié)合，也可以和酶-底物復(fù)合物結(jié)合，抑制劑結(jié)合的位點和活性中心位點不在相同的表位，最終也會導(dǎo)致酶催化活性的喪失。在非競爭性抑制劑存在的情況下，酶相對于底物的Km和Vmax測定時，測得得表觀Km值不變，Vmax值降低，如下圖所示：

uncompetitive不競爭性抑制劑

    不競爭性抑制劑只和酶-底物復(fù)合物結(jié)合，形成失活的抑制劑-酶-底物復(fù)合物。酶相對于底物的Km和Vmax測定時，測得得表觀Km值降低，Vmax值降低。如下圖所示：

不同類型抑制劑Ki和IC50之間的關(guān)聯(lián)

    Ki描述的是抑制劑和酶的結(jié)合強(qiáng)弱，是抑制劑和酶的解離平衡常數(shù)，是個狀態(tài)函數(shù)，不會受到反應(yīng)體系中底物濃度的影響，不同實驗得到的Ki值具有可比性；而IC50則是在特定酶學(xué)檢測方法中酶活抑制一半時抑制劑的濃度，根據(jù)不同類型的抑制劑，底物濃度可能對IC50產(chǎn)生影響，不同實驗得到的IC50值不具可比性。根據(jù)不同類型的抑制劑，在理想條件下（酶濃度遠(yuǎn)遠(yuǎn)小于底物濃度進(jìn)行反應(yīng)），Ki和IC50的關(guān)系如下：

    不同抑制劑類型IC50和反應(yīng)體系中加入的底物濃度的關(guān)系示意圖如下： 

展望：

絕大多數(shù)生命活動的調(diào)控均是有酶的參與，對酶的選擇性抑制可以調(diào)控細(xì)胞的增殖、分化、凋亡以及免疫調(diào)節(jié)等許多重要的生物學(xué)過程，如JAK抑制劑，IDO抑制劑等在臨床研究或者市場上證明了其價值或者潛在的價值。了解酶學(xué)反應(yīng)的化學(xué)原理，搭建合適的酶學(xué)篩選模型；表征酶抑制劑的不同抑制機(jī)理，也有助于細(xì)微區(qū)分不同抑制機(jī)理藥物可能起到的差異性的臨床獲益。
利用酶催化反應(yīng)進(jìn)行體外的功能學(xué)檢測也是常用的工具，如ELISA中HRP酶的催化顯色，細(xì)胞活性檢測時琥珀酸脫氫酶催化的CCK8檢測，報告基因檢測過程中l(wèi)uciferase酶催化的化學(xué)發(fā)光等，了解其化學(xué)原理和動力學(xué)反應(yīng)進(jìn)程有助于功能學(xué)方法學(xué)開發(fā)，優(yōu)化檢測方法的條件。
酶催化反應(yīng)是理解體外生物功能學(xué)評價體系承上啟下的一環(huán)，此反應(yīng)過程描述了是從Binding(affinity)轉(zhuǎn)換到function（potency）的過程，且在理想條件下此過程是線性傳遞的，即產(chǎn)物生成量是ES的量和Kcat的乘積，Vp=[ES]*Kcat。與之相對的，蛋白相互作用過程中，只有Binding(affinity)，大部分受體介導(dǎo)的細(xì)胞學(xué)效應(yīng)既有Binding(affinity)，也有function（potency），但是由Binding(affinity)到function（potency）之間的傳遞往往是非線性的，每種細(xì)胞由于其細(xì)胞內(nèi)環(huán)境蛋白的表達(dá)差異性會導(dǎo)致由胞外結(jié)合引起的刺激非均一放大形成差異性效用。下一篇筆者將會對更為復(fù)雜的細(xì)胞學(xué)相關(guān)測定方法進(jìn)行討論。

參考資料
《Guidance for Assay Development & HTS》
SECTION V: ENZYMATIC ASSAYS
SECTION XII: MECHANISM OF ACTION ASSAYSFOR ENZYMES