微生物來源藥物制備工藝研究中質(zhì)量控制要素討論
通過微生物發(fā)酵（生物合成）獲得治療疾病的化學(xué)或生物學(xué)物質(zhì)，是藥物研發(fā)的一個重要途徑，尤其近年來，隨著生物工程技術(shù)的迅猛發(fā)展，新藥物研發(fā)領(lǐng)域得到進一步拓寬。同時，通過對生產(chǎn)菌種的選育和優(yōu)化獲取優(yōu)良菌株，提高產(chǎn)品質(zhì)量和收率，也成為藥物研發(fā)的熱點領(lǐng)域之一。生物合成的工藝過程不同于化學(xué)反應(yīng)過程，既涉及生物細(xì)胞的生長、生理和繁殖等生命活動過程，又涉及生物細(xì)胞分泌的各種酶所催化的生化反應(yīng)及酶化學(xué)反應(yīng)過程，對產(chǎn)品質(zhì)量產(chǎn)生影響的因素遠(yuǎn)較化學(xué)合成反應(yīng)多且復(fù)雜。本文就如何通過菌種來源、鑒定和保藏的源頭控制、發(fā)酵和提取工藝研究及工藝參數(shù)確立的過程控制的手段把握產(chǎn)品質(zhì)量展開討論。
微生物發(fā)酵法生產(chǎn)藥品的工藝過程大體相同，一般的工藝程序為：生產(chǎn)菌株→孢子制備→種子制備→發(fā)酵→發(fā)酵液預(yù)處理及過濾→提取及精制→成品檢驗→包裝→放行檢驗。一般說來，從孢子制備到發(fā)酵屬于“生物合成”范籌，從發(fā)酵液預(yù)處理到提取精制屬于“化學(xué)工程”范籌。無論是“生物合成”還是“化工操作”階段，均存在影響產(chǎn)品質(zhì)量的重要因素。由于發(fā)酵過程的復(fù)雜性，通過對生產(chǎn)菌株相關(guān)要素的“源頭控制”以及“生物合成”、“化工操作”階段工藝要素的“過程控制”對于確保產(chǎn)品質(zhì)量更具重要意義。
1、菌種來源
從出發(fā)菌（多為野生菌）到工程菌，一般要經(jīng)過一系列的誘變、選育過程，菌種選育的目的是為改良菌種的特性，能夠得到目標(biāo)物且符合商業(yè)化生產(chǎn)的要求，如：優(yōu)化產(chǎn)品組份、提高產(chǎn)品質(zhì)量、抵抗不良條件、簡化生產(chǎn)條件、提高產(chǎn)品收率等。人們從生長在土壤中的放線菌、真菌、細(xì)菌中篩選目標(biāo)物的同時，已拓展到土壤中的稀有放線菌、海洋微生物和生長在特殊環(huán)境中的微生物。菌種選育的方法包括經(jīng)典的自然選育和誘變育種以及現(xiàn)代的雜交育種、原生質(zhì)體融合、基因工程等菌種選育技術(shù)，通過基因工程技術(shù)構(gòu)建新藥產(chǎn)生菌，大大加快了育種速度。選擇出發(fā)菌株時應(yīng)考慮出發(fā)菌株的穩(wěn)定性，盡量挑選純系菌株，以排除異核體與異質(zhì)體菌株。出發(fā)菌株對誘變因素敏感可以提高突變頻率，菌株的生理狀態(tài)及不同的生長發(fā)育時間與誘變效應(yīng)密切相關(guān)，一般細(xì)菌處理其營養(yǎng)體，真菌和放線菌處理它們的孢子，并以對數(shù)生長期為佳。翔實的菌種來源資料，應(yīng)能詳細(xì)說明從野生菌種到生產(chǎn)菌株進行了那些處理，以便從源頭掌握產(chǎn)品質(zhì)量信息。
得到的工程菌應(yīng)具備一定的遺傳穩(wěn)定性，需提供傳代10代以上的記錄和研究資料，說明菌株在多次傳代后，生物學(xué)特征以及目標(biāo)物的產(chǎn)生量等是否發(fā)生改變、是否發(fā)生了變異，以確保菌種在生產(chǎn)中不會發(fā)生回復(fù)突變；同時，工程菌這種淵源關(guān)系的把握不僅便于從源頭掌控藥品質(zhì)量，而且對于知識產(chǎn)權(quán)的保護亦為一種有效措施，比如，采用某機構(gòu)的標(biāo)準(zhǔn)菌株為出發(fā)菌，經(jīng)一系列誘變、選育得到工程菌生產(chǎn)目標(biāo)物，但很多機構(gòu)的標(biāo)準(zhǔn)菌株僅供科學(xué)研究使用，如用于商業(yè)用途須經(jīng)許可，否則，將會引發(fā)知識產(chǎn)權(quán)的法律糾紛，同時，這種做法也不符合菌種篩選的習(xí)慣做法；以野生菌為出發(fā)菌得到能產(chǎn)生目標(biāo)物的工程菌在過去幾十年中一致是人們發(fā)現(xiàn)新目標(biāo)物的主要途徑，在菌種選育過程中獲得其遺傳標(biāo)記，對日后申請知識產(chǎn)權(quán)保護、避免法律糾紛具有重要意義，需引起相關(guān)關(guān)注。
2、菌種鑒定
生產(chǎn)菌株是生物合成的主要基礎(chǔ)，應(yīng)能保證在特定條件下能夠穩(wěn)定產(chǎn)生目標(biāo)物，同時還要具備產(chǎn)量高、遺傳穩(wěn)定和容易培養(yǎng)等特點。工程菌既是藥物制備過程的微型（生物）反應(yīng)器，又是參與反應(yīng)的原材料，因而對于藥品質(zhì)量的影響是顯而易見的。要求提交菌種鑒定資料，主要目的是判斷菌種的可靠性和特異性，以便從源頭上把握產(chǎn)品的質(zhì)量信息，確保擬定的制備工藝能夠始終如一地生產(chǎn)出目標(biāo)產(chǎn)品。提供的菌種鑒定資料應(yīng)能準(zhǔn)確、全面、特異性地把握其特征，有些申報資料僅提供了菌株的形態(tài)特征，難以確定生產(chǎn)菌的種屬特征；目前的菌種的分類檢定主要依據(jù)細(xì)菌的形態(tài)學(xué)、代謝產(chǎn)物、酶活性和表面抗原等表型特征,這些方法能對菌種進行初步分類。隨著分子生物學(xué)的發(fā)展,出現(xiàn)了多種對細(xì)菌分類、鑒定的DNA 技術(shù),因此，需要提供其形態(tài)特征、培養(yǎng)特征、生理生化反應(yīng)、目標(biāo)物的胞內(nèi)胞外含量數(shù)據(jù)和細(xì)胞壁化學(xué)組分的研究信息，以確定生產(chǎn)菌的種屬，并結(jié)合菌種特點，采用DNA技術(shù)，提供專屬性能特定到“株”的菌種鑒別資料。對于獲得微生物次級代謝產(chǎn)物來講，代謝途徑的特異性強，不能保證不同種屬或同一種屬內(nèi)不同菌株有同樣的生產(chǎn)能力或得到相同的目標(biāo)物，菌種鑒別應(yīng)當(dāng)準(zhǔn)確到株。但在具體操作層面可能會存在一些困難，最大問題在于微生物分類學(xué)并非成熟的學(xué)科，目前對如何分類還存在爭議。對工業(yè)上應(yīng)用較廣泛的放線菌，目前的研究水平也往往只能鑒定到屬或種；16SRNA基因序列分析作為一種較先進的微生物分類手段，特異性和靈敏度較好，可用于檢定生產(chǎn)菌的種屬，但不一定適用于同種不同株的生產(chǎn)菌鑒別。國內(nèi)企業(yè)不像國外的企業(yè)，很多都沒有對自己的生產(chǎn)菌株進行遺傳標(biāo)記，因此菌種鑒別存在困難。但可以結(jié)合具體菌株的代謝情況，提供有特異性的分類學(xué)證據(jù)，菌種鑒別準(zhǔn)確到株。
目前申報單位通常的做法是以目標(biāo)產(chǎn)物的量為生產(chǎn)菌株鑒別的標(biāo)志，但這種做法存在某種程度上的概念錯誤。特異地積累某種產(chǎn)物并不能作為菌種分類學(xué)的關(guān)鍵性證據(jù)，但可以作為考察菌種遺傳穩(wěn)定性的重要指標(biāo)。因此，在進行菌種鑒別時，應(yīng)當(dāng)以微生物分類學(xué)為基礎(chǔ)，在形態(tài)、分子生物學(xué)水平進行相應(yīng)研究，以一系列的特性來標(biāo)明該菌株異于其它菌株的特征。
對于代謝路徑問題，因目前的研究水平一般可以揭示微生物在合成終產(chǎn)品時的代謝路徑，且明確代謝路徑對控制結(jié)構(gòu)類似物很有幫助，在研究資料中應(yīng)當(dāng)提供。但有申請人可能出于保密的考慮，通常不愿意提供，給此類品種的技術(shù)評價帶來很大困惑，也對產(chǎn)品注冊進程產(chǎn)生了不利影響。
3、菌種保藏
微生物菌種在多次傳代中會發(fā)生遺傳性變異，而且多為退化性變異，久置的菌種還會死亡，所以菌種應(yīng)妥善保藏，使之能長期保持存活、不退化，以便從源頭保障產(chǎn)品質(zhì)量的穩(wěn)定。菌種保藏條件選擇應(yīng)根據(jù)菌種的生理生化特點選擇確定，使得菌體的代謝活動處于不活波的狀態(tài)。保藏時，應(yīng)首選優(yōu)良純種的休眠體（孢子、芽孢等）在一種最有利于其休眠的環(huán)境條件（如低溫、干燥、缺氧和缺乏營養(yǎng)物質(zhì)等），以降低菌種代謝活動的速度，達(dá)到長期保存的目的。一種較好的保藏方法應(yīng)能較長期的保存原有菌種的優(yōu)良特性，一般的保藏方法有定期移植保藏法、液體石蠟封藏法、真空冷凍干燥保藏法、液氮超低溫保藏法以及沙土管保藏法和麩皮保藏法等，如何選擇，需根據(jù)菌種特點和具體條件經(jīng)篩選研究確定。
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